含Sushi重复蛋白X连锁2基因敲除对肺腺癌A549细胞生物学特性的影响

赵 隽，温 松，于法明，姜东亮，李慎柯

(1.新乡医学院，河南 新乡 453003；2.濮阳市油田总医院呼吸科，河南 濮阳 457001)

据统计，在世界范围内，肺癌是癌症所致死亡的首要原因[1]。肺腺癌是非小细胞肺癌的一种，占肺癌患者总数的40%左右[2]。含Sushi重复蛋白X连锁2(Sushi repeat containing protein,X-linked 2,SRPX2)是一种新型的硫酸软骨素蛋白聚糖，可影响细胞的迁移、黏附等生物学行为，并具有促血管生成作用[3]。 SRPX2最早在白血病细胞中被发现[4]，在食管癌、胃癌、肝癌、子宫内膜腺癌、结肠癌等多肿瘤细胞中均存在过度表达[5-9]。有研究表明，SRPX2与肿瘤细胞的侵袭和迁移密切相关[10]。但SRPX2在肺腺癌细胞中的生物学特性和功能尚不清楚。基于此，本研究采用成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)-CRISPR 相关蛋白9(CRISPR associated protein 9，Cas9)基因编辑技术敲除肺腺癌人类肺泡基底上皮细胞A549细胞中的SRPX2基因，观察SRPX2基因对肺腺癌细胞生物学特性的影响，以期为开发肺腺癌新的有效的治疗靶点或预后标志物提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器野生型肺腺癌人类肺泡基底上皮细胞系A549细胞、快速核酸释放试剂、CRISPR-U敲除质粒购自广州源井生物科技有限公司，胎牛血清、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbeco′s modified Eagle′s medium，DMEM)、NeonTM转染系统试剂盒(重悬缓冲液 R、重悬缓冲液E2)购自美国Thermo Fisher Scientific公司，嘌呤霉素购自美国Invivogen公司，细胞周期检测试剂盒、细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)购自上海碧云天生物技术有限公司，DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；台式冷冻离心机、CO2恒温培养箱、移液器、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪、电转仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司，流式细胞仪购自日本NIKON公司，酶标仪购自美国BioTek公司，电泳仪购自北京六一仪器公司。CRISPR-UTM表达质粒[含小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)、Cas9、增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)基因荧光标签及抗嘌呤霉素基因]、本研究所用引物的合成由广州源井生物科技有限公司完成。

1.2 细胞培养与分组将A549细胞培养于含体积分数10%胎牛血清、100 mU·L-1链霉素和100 mU·L-1青霉素的DMEM中，置于37 ℃、含体积分数5% CO2的细胞培养箱中培养。根据是否敲除SRPX2基因将A549细胞分为对照组和敲除组，敲除组细胞采用CRISPR-Cas9方法敲除SRPX2基因，对照组细胞常规传代培养。

1.3 SRPX2基因敲除肺腺癌细胞系构建

1.3.1 CRISPR-Cas9法敲除A549细胞SRPX2基因将对数生长期的A549细胞制成单细胞悬液，细胞计数后取3×106个细胞置于无菌管中，300×g离心4 min，弃上清，取600 μL重悬缓冲液R重悬细胞沉淀，然后加入30 μg无内毒素的CRISPR-UTM表达质粒混匀，备用。电击杯中加入3 mL重悬缓冲液E2，使用100 μL电转枪头吸取A549细胞与CRPSPR-UTM表达质粒的混合物，插入电击杯中电击，以敲除部分SRPX2基因序列(5′-TAGTGGCACTTACACCTGCACAAATGGAGTGCTTCTTGACTCTCG-CTGTGACTACAGCTGTTCCAGTG-3′，长度为68 bp)。电转完成后，将细胞接种于6孔板中继续培养。转染24 h后，显微镜下观察电转效果，选择细胞存活率较高及表达绿色荧光蛋白细胞相对较多的孔，更换为含有终质量浓度1 mg·L-1嘌呤霉素的完全DMEM筛选并培养72 h。

1.3.2 筛选SRPX2基因敲除单克隆细胞并验证使用有限稀释法将对照组和敲除组A549细胞分别稀释并接种至96孔板，每孔100个细胞，置于37 ℃、含体积分数5% CO2细胞培养箱中静置培养，培养1周后观察细胞克隆的生长情况，标记含有单克隆细胞簇的孔。当标记的单克隆细胞汇合度达到40%～60%时，将96孔板内的培养基倾倒干净，加入100 μL快速核酸释放试剂，室温静置10 min，1 000×g离心5 min，取上清(细胞核酸)。分别使用引物F1/R1(扩增SRPX2基因829 bp)和引物F1/R2(扩增SRPX2基因至部分敲除序列355 bp)对敲除组和对照组细胞核酸进行PCR扩增，PCR反应体系： DNA模板1 μL，2×Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL双蒸水22 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性 3 min，95 ℃变性15 s，95 ℃退火15 s，72 ℃延伸50 s，30个循环；72 ℃终延伸5 min。SRPX2基因引物序列如下：F1:5′-AATGTACAGTGTTAGGTCTGATTTTG-3′；R1:5′-GGGTCCCAGTATACTCGAGC-3′，R2:5′-GTCACAGC-GAGAGTCAAGAAG-3′。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下呈像得到电泳图谱。将目的条带进行胶回收，并测序。根据PCR产物电泳图谱及测序结果，将成功敲除SRPX2基因的阳性克隆A549细胞继续传代培养并于液氮中冻存，获得SRPX2基因敲除的A549肺腺癌细胞系(敲除组)。由广州源井生物科技有限公司完成对PCR扩增产物的DNA测序工作。

1.4 流式细胞术检测细胞周期取敲除组及对照组生长状态良好的对数生长期细胞，以每孔约5×104个细胞分别接种于2个6孔细胞板中，每组设置3个复孔。2个6孔细胞板分别培养24、48 h时，用胰蛋白酶消化细胞，1 000×g离心 5 min，弃上清；加入约1 mL预冷的磷酸盐缓冲溶液洗涤，重悬细胞，转移到1.5 mL离心管中，1 000×g离心5 min，弃上清。加入1 mL预冷的体积分数70%乙醇，轻轻吹打混匀；置于4 ℃冰箱中固定12 h；1 000×g离心5 min沉淀细胞；再用预冷的磷酸盐缓冲溶液洗涤，1 000×g离心 5 min，弃上清。加入0.5 mL细胞周期检测试剂盒中的碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀。37 ℃避光温浴30 min，使用流式细胞仪和FlowJo软件检测细胞周期分布情况。实验重复3次，取均值。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖情况取敲除组及对照组对数生长期细胞，细胞融合率达到80%～90%时，用胰蛋白酶消化，磷酸盐缓冲溶液重悬细胞，300×g离心3 min，用细胞计数板进行细胞计数后调整细胞密度为4×107L-1，接种于5个96孔板中，每孔100 μL，分别于培养0、24、48、72、96 h时，每孔加入10 μL CCK-8试剂，置于细胞培养箱中孵育2 h，使用酶标仪检测波长450 nm处吸光度值。吸光度值越高表示细胞增殖能力越强。实验重复3次，取均值。

1.6 Transwell小室实验检测细胞迁移能力取敲除组及对照组对数生长期细胞，弃上清后使用磷酸盐缓冲溶液洗涤2次，胰蛋白酶消化细胞，300×g离心3 min，弃上清，使用培养基重悬细胞并计数，调整细胞悬液为5×108L-1，取100 μL上述细胞悬液滴加于2个Transwell板上室中，下室加入500 μL含体积分数15%胎牛血清的DMEM，分别于培养24、48 h后取出小室，吸弃培养基，用棉签轻轻擦拭上室内的细胞。取新的24孔板加入40 g·L-1多聚甲醛600 μL，将上室放入，固定30 min；弃固定液，加入体积分数0.1%结晶紫600 μL染色10 min，使用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，弃去未与细胞结合的结晶紫，用棉签轻轻擦拭小室的上侧；适当风干后，于高倍显微镜下随机选取5个视野拍照并计数迁移细胞数。实验重复3次，取均值。

2 结果

2.1 SRPX2基因敲除鉴定结果结果见图1。敲除组细胞成功敲除SRPX2基因68 bp序列。对照组细胞使用引物F1/R1、F1/R2扩增后的产物序列大小分别为829 bp、355 bp，敲除组细胞使用引物F1/R1、F1/R2扩增后的产物序列大小分别为761 bp、0 bp。

1：敲除组，引物F1/R1；2：对照组，引物F1/R1；3：敲除组，引物F1/R2；4：对照组，引物F1/R2；M：Marker。

2.2 2组肺腺癌细胞A549细胞周期分布比较结果见表1和图2。培养24 h时，敲除组G0/G1及S期细胞所占比例显著低于对照组，G2/M期细胞所占比例显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。培养48 h时，敲除组S期细胞所占比例显著低于对照组，G2/M期细胞所占比例显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。培养48 h时，对照组与敲除组G0/G1期细胞所占比例比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 2组不同细胞周期细胞比较

图 2 2组不同细胞周期细胞分布情况

2.3 2组肺腺癌A549细胞增殖能力的比较结果见表2。培养0、24、48、72、96 h时，2组细胞的增殖能力随时间的延长均呈升高趋势(P<0.05)。培养0、24、48、72、96 h时，2组细胞的增殖能力比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2 2组A549细胞增殖能力比较

2.4 2组肺腺癌A549细胞迁移能力的比较结果见图3。培养24 h时，对照组和敲除组的迁移细胞数分别为(24.200±3.899)、(6.800±1.304)个；培养48 h时，对照组和敲除组迁移细胞数分别为(92.200±6.419)、(48.800±2.280)个。培养24、48 h时，敲除组迁移细胞数显著少于对照组，差异有统计学意义(t=9.464、14.247，P<0.05)。

图3 2组A549细胞迁移情况(结晶紫染色，×40)

3 讨论

肺癌是我国高发肿瘤之一，且病死率最高[2]。肺癌患者中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占80%左右[11]。近年来，虽然肺癌的诊断和治疗取得了一定的进步，但半数以上的肺癌患者临床诊断较晚，5 a生存率低于20%[3]。目前，虽然肺腺癌靶向治疗取得一定的进步，但已进入了一个瓶颈期，关于新的治疗靶点报道较少。因此，研究肺腺癌的发生、发展机制，寻找新的有效的生物靶标在肺腺癌的早期诊断、治疗及预后评估中具有非常重要的作用。

SRPX2在不同恶性肿瘤组织中呈过表达，是食管癌、前列腺癌、肝细胞性肝癌、胰腺癌、结直肠癌以及胃癌的不良预后因素[12-15]。SRPX2可通过调控不同信号通路，参与肿瘤细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭等生物学过程[10，14,16-17]。TANG等[18]研究发现，SRPX2在人胶质母细胞瘤组织中的表达显著上调，且SRPX2的过表达显著诱导胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭。此外，SRPX2对血管生成具有积极作用[19-20]。但目前尚无研究报道SRPX2在肺腺癌发生发展中的生物学作用。

本研究结果显示，培养24 h时，敲除组G0/G1及S期细胞所占比例显著低于对照组，G2/M期细胞所占比例显著高于对照组；培养 48 h时，敲除组S期细胞所占比例显著低于对照组，G2/M期细胞所占比例显著高于对照组；培养48 h后，2组G0/G1期细胞所占比例比较差异无统计学意义；说明将A549细胞的SRPX2基因敲除对细胞周期进程产生影响，主要表现为S期细胞所占比例显著下降，G2/M期细胞比例显著增高，提示细胞周期被阻滞在G2/M期，从而抑制了细胞的增殖分裂， SRPX2可能通过调控A549细胞周期促进细胞分裂，这与SRPX2在食管癌细胞周期调控中的作用相似[21]。

HONG等[22]的研究表明，SPRX2基因敲除显著抑制前列腺癌细胞的增殖。本研究结果显示，2组细胞的增殖能力随时间的延长均呈升高趋势；培养0、24、48、72、96 h时，2组细胞的增殖能力比较差异均无统计学意义；这表明将A549细胞的SRPX2基因敲除不影响细胞的增殖能力，SRPX2在肺腺癌细胞增殖中未起到关键性作用。根据细胞周期实验结果推测，SRPX2敲除可导致A549细胞增殖被抑制，但是，细胞增殖实验结果显示，SRPX2对A549细胞增殖无明显影响；分析原因可能是细胞铺板密度较高，影响细胞的增殖；或者是本研究的增殖实验观察时间较短，未观测到细胞增殖的时间节点；也可能是细胞凋亡增多等原因共同导致的结果，后续仍需进一步研究证实。

此外，本研究结果显示，敲除组迁移细胞数显著少于对照组，说明将A549细胞的SRPX2基因敲除降低了A549细胞的迁移能力，提示SRPX2可能参与肺腺癌A549细胞的迁移过程，促进肺腺癌的临床进展，可能与肺腺癌患者的预后不良相关。LIN等[23]研究发现，SRPX2可促进肝癌细胞的迁移和侵袭，而肿瘤细胞迁移到其他组织或器官会导致患者预后不良和存活率下降[24-25]。因此，SRPX2基因可能成为肺腺癌治疗新的靶点。

综上所述，敲除肺腺癌A549细胞中SRPX2基因可显著抑制细胞的迁移、阻滞细胞周期，SRPX2基因可能成为肺腺癌治疗的新靶点。本研究有助于为将来进一步探索和阐明SRPX2在肺腺癌发生发展中的作用以及其在肺腺癌的临床诊疗和预后评估中的作用提供实验依据。