膀胱癌患者来源的异种移植物模型构建与应用研究进展

李杨东，范毛川，窦启锋

(新乡医学院第一附属医院泌尿外科，河南 卫辉 453100)

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率分别占全部新发癌症的 3.0%和2.1%[1-2]。近年来，膀胱癌的临床治疗主要采用部分或全膀胱切除术辅以常规放化疗，但该治疗方案的预后较差，常伴有多种不良反应。随着膀胱癌相关研究的不断深入，细胞系衍生的异种移植物模型提高了人们对癌症进展和药物治疗作用机制的认知，但此类异种移植物模型缺乏原发肿瘤的异质性。人源性异种移植物(patient-derived tumor xenograft，PDX)模型不仅保留了与原始肿瘤相似的细胞形态、结构和分子特征，还被广泛认为是比标准细胞系更加具有生理相关性的临床前模型[3]，能准确预测化学治疗药物的临床反应，再现人类肿瘤的异质性，因此，学者对肿瘤研究中PDX模型的开发和应用越来越感兴趣。针对PDX模型的研究有望应用于指导肿瘤患者的个性化治疗，以改善患者的生存质量。本文就既往关于PDX模型构建时小鼠种类、移植部位及方式的相关研究报道进行综述，旨在总结不同构建方式的差异，为其应用于膀胱癌治疗的研究提供参考。

1 膀胱癌PDX模型的构建

1.1 构建膀胱癌PDX模型所用的移植物样本的获取方式制备异种移植物模型所用的患者肿瘤组织主要来源于手术切除的病理组织，在目前广泛采用的PDX模型的构建中，其前期准备一般采用2种方法：一是将肿瘤组织切割成1～5 mm3大小不等的碎块置于含有青霉素、链霉素的培养基中进行培养[4-7]，二是将肿瘤组织裂解为单个细胞悬浮液后用基质凝胶进行培养[8]。这2种方法均有效提高了异种移植的成功率。除此之外，也有研究通过细针穿刺活检的方式获取患者来源的肿瘤组织，用于构建PDX模型[9-10]；但与传统的移植物提取方式相比，这种通过活检样本建立PDX模型的成功率较低，因此，该方式很少用于膀胱癌患者肿瘤组织的提取。

1.2 膀胱癌PDX模型构建中免疫缺陷小鼠的选择近年来，通常选用缺乏完整免疫系统(即体内缺乏功能性T、B淋巴细胞)的小鼠来构建PDX模型，此类小鼠能够避免异种移植的肿瘤细胞所产生的免疫反应，故而成为了癌症研究中常用动物模型的选择之一[11-12]。有研究证实，将患者来源的肿瘤组织植入免疫缺陷小鼠皮下而构建的PDX模型比肿瘤细胞系模型能更准确地反映原发肿瘤的生物学特性[13]。一些团队基于免疫缺陷小鼠的特殊性，成功构建了包括非小细胞肺癌、胃癌、卵巢癌和结肠癌等在内的多种类型的PDX模型[14-17]，这些模型中的肿瘤组织具有与原发肿瘤相似的主要组织学和遗传学特征[18]，在一定程度上保留了原发肿瘤的异质性。

目前，构建PDX模型所用的小鼠种类较多，采用不同小鼠所形成的PDX模型的移植成功率存在差异。一项系统性研究显示，在制备PDX模型的研究中，异种移植成功率由低到高的免疫缺陷小鼠依次为无胸腺裸鼠、重度联合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID)小鼠、非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency，NOD/SCID)小鼠和重度免疫缺陷(NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Sug/JicCrl，NOG)小鼠[19]。NOD/SCID小鼠是SCID 小鼠与非肥胖糖尿病小鼠品系回交的免疫缺陷鼠，其不仅具有SCID 小鼠的特征，如缺乏功能性T 细胞和B 细胞，还具有非肥胖糖尿病小鼠的多种固有免疫缺陷的特点[20]。白细胞介素-2受体γ链(interleukin-2 receptor γ chain，IL-2Rγ)基因缺乏的NOD/SCID 小鼠又被称为严重免疫缺陷(NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtml/Bcgen，NSG)小鼠，是在NOD/SCID 小鼠基础上敲除IL-2Rγ基因，从而使其缺失成熟T淋巴细胞、B淋巴细胞及自然杀伤(natural killer,NK) 细胞，其免疫缺陷最严重，是异种移植、人源化小鼠、免疫重建的重要载体[21-22]。NOG 小鼠缺乏成熟的T、B 细胞和NK 细胞，补体活性减少，巨噬细胞和树突状细胞功能紊乱[23]。与NOD/SCID 小鼠相比，NOG小鼠的人体细胞和组织移植存活率显著提高，可成为人类免疫细胞移植的理想模型。虽然，关于构建PDX模型选用何种小鼠尚无统一明确的观点，但其共同点均为免疫缺陷小鼠。

1.3 肿瘤移植部位的选择目前的研究中最常见的肿瘤移植部位有原位移植和皮下移植，但不同移植部位对异种移植物的生长会有所影响。原位移植是将人类肿瘤组织接种到与肿瘤原发部位相对应的移植宿主的组织器官内，使其获得与人体肿瘤相似的微环境。该移植方式高度还原了肿瘤细胞及其周围间质之间组织微环境的相互作用及肿瘤生长情况。PAN等[24]将从患者身上所获取的膀胱肿瘤组织裂解为单细胞悬液，并植入NSG 小鼠的膀胱内，建立了膀胱癌原位PDX模型。但这种移植技术难度系数较高，不易于操作。相比而言，皮下移植瘤模型操作简单，成瘤率高，并能方便、实时检测肿瘤的生长情况和评估药物治疗效果。皮下移植为最常见的异种移植部位，通常于小鼠的肾包膜下或双侧肾囊以及小鼠侧腹部移植肿瘤组织并能连续传代[25-27]。在肾包膜下接种患者肿瘤组织也被证实是最可靠的移植部位，这可能与移植部位的血液供应丰富、新血管快速生成有关。尽管肾囊并不是膀胱癌的生理初始位置，但却是PDX 模型存活和生长的最佳移植部位。有学者在小鼠双侧肾囊下注射患者膀胱肿瘤组织后，成功构建了PDX 模型[25]。总体而言，原位移植和皮下移植存在互补关系，前者能评估肿瘤微环境中的特异性，而后者有利于研究上皮-基质相互作用在肿瘤生长中的意义。因此，尚无研究明确表示PDX 模型的最佳移植部位。

2 PDX模型在膀胱癌研究中的应用

膀胱癌是最常见的癌症之一，其具有高复发率及高进展率等特点。近年来，膀胱癌的发病率和病死率呈逐渐上升趋势，成为严重威胁人类健康的主要疾病[28]。虽然新的膀胱癌治疗方法不断涌现，但其治疗研究进展受到体内外实验条件的限制。动物肿瘤模型是研究癌症进展的有效工具。PDX 模型是目前最常用的癌症治疗研究的体内模型之一[29]，该模型不仅能很好地保留患者肿瘤的生物学特征，还再现了肿瘤异质性[30]。20世纪70年代，WELDON等[31]首次建立了将癌细胞递送到膀胱腔内的动物模型构建方法，目前此方法已广泛应用于膀胱癌治疗领域的基础研究。有研究使用细胞解离剂将培养为球体的膀胱癌患者来源的癌症细胞(patient-derived cancer cell，PDC)分解为单个悬浮细胞，并将其注射到免疫缺陷雄性NOG小鼠的腹侧皮下而成功建立了PDX 模型；苏木精-伊红染色显示，由PDC衍生的异种移植肿瘤能表现出与原发肿瘤相似的形态特征[32]，有望成为研究膀胱癌致瘤性和耐药性的重要载体，并有利于未来传统肿瘤治疗模式向精准化、个体化的发展。目前，PDX模型被用于肿瘤患者的临床前药物评估、生物标志物识别以及个性化药物研发，以预测肿瘤患者的临床治疗效果[33]。目前，有学者在基于膀胱癌PDX 模型的应用条件下，采用噻唑蓝比色法筛选出了治疗膀胱癌的药物组合[24]。另外，有研究表明，按照临床剂量的联合用药方式能有效减缓膀胱癌PDX模型的生长[34]，这可能对一些膀胱癌患者的治疗研究有益。也有研究表明，在鉴别高危膀胱癌及发现膀胱癌生物标志物方面，PDX模型都发挥着重要作用[35]。这些发现为膀胱癌患者治疗方案的选择提供了参考依据。另外，相应的PDX模型临床前试验结果已经被证实与肿瘤患者的相关研究结果一致[36-37]，这进一步表明了该模型能很好地概括人类肿瘤的组织学特点、分子特征和肿瘤异质性，为肿瘤精准治疗的发展提供了相关依据，为优化膀胱癌患者的个性化治疗提供了研究方向。

3 PDX模型的优势和不足

近年来，动物模型被广泛用于癌症研究，如由癌细胞系和基因工程小鼠模型开发的小鼠异种移植模型。尽管这些模型对癌症研究做出了巨大贡献，但在精准医学时代，它们未能满足不同患者的特定需求。PDX 模型在精准医学方面具有一定的独特优势，这是其他癌症模型无法比拟的。PDX模型的基本特征主要包含每个异种移植物都来自于随机选择的临床患者的肿瘤组织，与其供体组织具有相同的遗传背景，更利于将该模型应用于药物暴露研究，为不同患者提供特定需求及治疗。有学者认为,若是利用PDX模型进一步明确癌症干细胞的性质，将有助于研发针对癌症干细胞或同时针对其他癌症细胞的有效治疗方案[37]。这些研究表明，PDX 模型有利于加速药物开发的研究，也易于将患者衍生的癌症模型转化为临床应用，从而给予新的治疗建议。

虽然PDX 模型具有保留原发肿瘤组织学和分子特征的优势，但该模型在临床应用方面的价值仍具有诸多不足。首先，PDX模型需要手术切除患者的肿瘤组织用于培养异种移植物，但部分癌症患者并不接受任何肿瘤组织的手术切除术，且手术切除率因癌症类型多样而存在较大差异。较低的手术切除率不仅降低了患者肿瘤组织的获取率，还增加了PDX 模型构建的难度系数。其次，PDX模型的建立存在成本高、开发时间长(最多6个月)及移植率低的问题[38]。一般建立第1个PDX 模型通常需要4～5个月，而随后的PDX 传代仍需2～5周，如前列腺癌 PDX的生长速度较慢，需要数月才能生成模型[39]。通常为了增加移植成功率，会使用基质凝胶培养肿瘤组织，还会在微室中进行培养。这种由微室培养的方式与基质凝胶的培养效果基本一致，且传代周期显著缩短。据报道，条件重编程(conditional reprogramming，CR)技术可持续扩增细胞谱系，维持活检中细胞的异质性[40]。这种技术能够在体外扩增PDX 细胞或应用于高通量药物筛选试验及体外操作，可减少动物使用数量、肿瘤组织的变异性和研究成本。CR 技术能潜在地弥补体内PDX 模型的不足，并用于靶向治疗的转化性研究和开发。相对而言，CR 技术的发展速度更快，成本也较低。因此，CR 技术可作为体内PDX 模型的一种快速、低成本的替代方案。再次，虽然PDX 模型多选择肾包膜下移植或原位移植方式，但这2种移植方法的操作难度系数较高，通常需要影像学检测技术的辅助。最后，PDX模型常选用免疫缺陷小鼠为实验动物，以保持原发肿瘤组织的异质性，但由于宿主小鼠缺乏人体特定的免疫系统，使得该模型在免疫反应研究中存在一定程度的局限性。

总之，PDX 模型已被证明是一种具有高度预测能力的实验工具，可用于测试标准化学治疗后的治疗效果和识别受益于临床试验中新疗法的肿瘤类型。PDX模型是通过把个体患者的肿瘤组织移植到免疫功能低下的动物如严重免疫缺陷小鼠或裸鼠的体内而形成，所以该模型的异种移植物仍保留了原始肿瘤的细胞结构和分子标志。因此，PDX 模型再现了原发疾病的生物学特征，适用于评估单个患者的癌症化学治疗敏感性，为癌症治疗领域提供了一个潜在研究工具。

4 结语

越来越多的研究表明，膀胱癌PDX模型在药物筛选、生物标志物开发和联合临床试验等方面具有一定优势，但由于其免疫系统缺乏、移植成功率低、建模成本昂贵及时间较长等原因，使得PDX模型的应用具有局限性。尽管如此，膀胱癌PDX模型这一类癌症临床前模型对于临床治疗领域的研究仍然是至关重要的。因此，人们需要对PDX模型的研究进行不断的完善与改进，从而推动其更好地发展。