SKP1、SKP2对肾癌预后的预测作用分析

杨伟芳 杨海华 冉刚 皮文虎 王学全

肾癌在全球男性、女性恶性肿瘤中发病率分别列第6位、第8位，且呈逐年上升趋势。由于早期症状不典型及缺乏高灵敏度、高特异度的肿瘤标志物，约20%的肾癌患者在确诊时已发生远处转移[1]。肾癌患者5年生存率75%，而有远处转移患者5年生存率仅10%～12%[2]。免疫治疗以及免疫联合靶向治疗的发展为肾癌治疗带来新的希望，但治疗有效率仍较低[3-4]。目前，肾癌尚缺乏简单的、有助早期诊断、指导治疗和预测预后的生物标志物。S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase-associated protein 2,SKP2）是 F-box蛋白的一种，它与CUL1、S期激酶相关蛋白1（SKP1）、环盒蛋白1（ring box 1,Rbx1）一起形成SCF-E3泛素连接酶复合体，通过泛素化对体内多种关键蛋白起调节作用。免疫检查点分子的表达以及免疫细胞的成熟、肿瘤微环境的塑造等均受泛素化系统的调节。研究报道SKP2影响肿瘤形成、转移、细胞周期发展、细胞衰老、凋亡、自噬、免疫应答、肿瘤放射敏感性、肿瘤药物敏感性等，是肿瘤治疗的关键靶点之一[5-11]。SKP1是SCF-E3泛素连接酶复合体的不变核心成分，负责结合CUL1并招募各种F-box蛋白用于SCF复合物的形成。SKP1和SCF复合物调节多种蛋白维持基因组稳定，包括DNA损伤修复、凋亡信号传导和中心体动力学等。SKP1表达异常可导致染色体不稳定，可能与肿瘤的发生相关，其具体机制尚不明确[12-14]。有研究报道肾癌组织标本中存在SKP2表达，且SKP2表达与肿瘤分期、分级和不良预后相关。肾透明细胞癌是肾癌最常见的组织学亚型，占70%～80%[15]，肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌等也是肾癌的常见类型。肾癌的不同病理类型中SKP2表达存在差异[16-18]。基于此，本研究通过多个数据库分析SKP1、SKP2表达水平对肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌这3种肾癌患者预后的预测价值，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 数据源和预处理 从https://xenabrowser.net/数据库中检索癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库并下载64例肾嫌色细胞癌，531例肾透明细胞癌，286例肾乳头状细胞癌患者的临床数据、RNA-seq数据、甲基化数据和突变数据，使用R.studio、R编程（4.03）软件进行数据分析。

1.2 肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌中SKP1、SKP2表达分析 使用“survminer”软件进行患者Kaplan-Meier生存分析，采用Cox回归分析SKP1、SKP2表达与这3种肾癌患者预后的相关性；pec包分析生存的一致性指数；risk Regression包计算时间依赖性ROC曲线下的AUC。

1.3 肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌临床病理特征及甲基化位点与SKP1和SKP2表达水平的关系分析 使用MEXPRESS数据库（http://mexpress.be）可视化分析这3种肾癌中临床病理特征及甲基化位点与SKP1、SKP2表达水平的关系。

1.4 SKP1、SKP2甲基化位点与肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌预后的关系分析 采用Cox回归分析SKP1、SKP2甲基化位点的甲基化水平与这3种肾癌患者预后的相关性。

1.5 肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌中SKP1、SKP2基因突变分析 采用cBioPortal网站分析SKP1、SKP2在这3种肾癌中的突变分布；使用R语言 maftools软件包中的oncoplot函数生成SKP1、SKP2高表达组和低表达组突变瀑布图。

1.6 基因功能富集分析和蛋白相互作用网络分析采用Pearson分析肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌中SKP2的共表达基因（r＞0.4，P＜0.05），然后采用Metascape数据库分析3种肾癌中SKP2共表达基因的功能富集（GO和KEGG）和蛋白质-蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction,PPI）。

1.7 统计学处理 使用R.studio软件和R编程（4.03）软件进行数据分析。正态分布的计量资料组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布的计量资料两组比较采用Mann-Whitney U检验。单因素和多因素Cox回归分析用于评估预后。生存分析采用Kaplan-Meier法和对数秩检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌组织SKP1、SKP2表达情况比较 与正常组织比较，SKP1基因表达水平在肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌组织中均降低（均P＜0.05），SKP2基因表达水平在肾透明细胞癌和肾乳头状细胞癌中升高（均P＜0.05），而在肾嫌色细胞癌中表达降低（P＜0.05），但在配对肿瘤组织中与正常组织无明显差异（均P＞0.05）。

2.2 SKP1、SKP2表达情况与肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌预后的关系 在肾透明细胞癌中SKP1表达降低者预后差（P＜0.05）。肾嫌色细胞癌和肾乳头状癌中SKP1表达高低与总生存期均无关（均P＞0.05）。SKP2表达升高与肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌的不良预后均有关（均P＜0.05）。肾透明细胞癌中SKP1、SKP2预测生存的AUC为0.6～0.7，一致性指数为0.6左右。肾嫌色细胞癌中SKP2预测生存的AUC为0.8～0.9，一致性指数稳定在0.8左右，预测准确度较好。肾嫌色细胞癌中SKP1预测生存的AUC为0.6～0.7，一致性指数为0.6左右。肾乳头状细胞癌中SKP2预测生存的AUC为0.7～0.8，一致性指数为0.6～0.7。肾乳头状细胞癌中SKP1的AUC和一致性指数偏低。单变量Cox回归分析结果表明SKP1是肾乳头状细胞癌和肾嫌色细胞癌患者的不良预后因素，而在肾透明细胞癌患者中，它被认为是一个有利的预后因素。SKP2是肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌患者的不良预后预测因素。

2.3 肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌临床病理特征及甲基化位点与SKP1和SKP2表达水平的关系 肾透明细胞癌组织SKP1表达水平与患者初诊时年龄（r=0.086，P＜0.05）、阳性淋巴结数目（r=0.292，P＜0.05）均呈正相关。肾乳头状细胞癌组织SKP1表达水平与性别、病理N分期、肿瘤分期等相关（均P＜0.05）。肾透明细胞癌组织SKP2表达水平与患者初诊时年龄、新辅助治疗史等相关（均P＜0.05）。肾乳头状细胞癌组织SKP2表达水平与患者性别、临床M分期、病理T分期、病理M分期、肿瘤分期等相关（均P＜0.05）。

肾乳头状细胞癌、肾嫌色细胞癌和肾透明细胞癌中各有8、9、9个甲基化位点与SKP1表达水平显著相关（均P＜0.05）；各有2、3、6个甲基化位点与SKP2表达水平显著相关（均P＜0.05）。ch.5.2450351R、cg19957803、cg04691829、cg20261922、cg00854995、cg26922706、cg04136748等7个甲基化位点与这3种肾癌SKP1表达水平均显著相关（均P＜0.05）。其中肾乳头状细胞癌中cg14641600、ch.5.2450351R、cg19957803、cg04691829、cg20261922、cg00854995、cg26922706、cg04136748等 8个甲基化位点与SKP1表达水平显著相关（均P＜0.05）。肾嫌色细胞癌中ch.5.2450351R、cg19957803、cg04691829、cg11916758、cg02717486、cg20261922、cg00854995、cg26922706、cg04136748等 9个甲基化位点与SKP1表达水平相关（均P＜0.05）。肾透明细胞癌中cg18516595、ch.5.2450351R、cg19957803、cg04691829、cg20261922、cg00854995、cg26922706、cg16653901、cg04136748等9个甲基化位点与SKP1表达水平显著相关（均P＜0.05）。肾乳头状细胞癌中cg27130364、cg04696559与SKP2表达相关（均P＜0.05）。肾嫌色细胞癌中cg24749912、cg12428978、cg27116787甲基化位点与SKP2表达呈负相关（均P＜0.05）。肾透明细胞癌中 cg08674342、cg16113047、cg01943654、cg21893846、cg04696559、cg14711201等6个甲基化位点与SKP2表达呈正相关（均P＜0.05）。

2.4 肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌SKP1、SKP2甲基化与患者预后的关系 对于SKP1和SKP2甲基化位点，肾乳头状细胞癌中有17个，肾嫌色细胞癌中有12个，肾透明细胞癌中有23个与总生存期相关（均P＜0.05）。其中SKP1 cg00854995、cg02717486、cg08584618甲基化位点与肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌总生存期呈正相关（均P＜0.05）。SKP1 cg04691829、cg16653901、cg19957803甲基化位点与肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌不良预后相关（均P＜0.05）。SKP2 cg08344341、cg08674342甲基化位点与肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌不良预后相关（均P＜0.05）。SKP2 cg15996282、cg27130364甲基化位点与肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌不良预后相关（均P＜0.05）。

2.5 肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌SKP1、SKP2的基因突变情况 OncoPrint分析结果显示，肾癌中SKP1基因突变占7%，突变类型是基因扩增；SKP2基因突变占0.4%，包括错配修复和基因扩增。其中肾透明细胞癌中SKP1和SKP2突变占14%。肾癌总体人群中，与无突变者相比，SKP1和SKP2突变与总生存期无关（P＞0.05）。

通过对这3种肾癌SKP1和SKP2高低表达组突变率最高的15个基因的分析显示，在肾透明细胞癌和肾乳头状细胞癌SKP2和SKP1高表达组中均存在KMT2C高突变，而低表达组该基因突变率较低。肾乳头状细胞癌、肾嫌色细胞癌SKP1低表达组存在HERC2突变。PRKDC突变在肾透明细胞癌SKP1低表达组和SKP2高表达组更常见。SETD2突变在肾透明细胞癌SKP1低表达组和SKP2高表达组突变更常见。肾透明细胞癌和肾乳头状细胞癌SKP2低表达组中存在HMCN1突变，而高表达组该基因突变率低，见图1、2（插页）。

图1 肾癌中S期激酶相关蛋白1（SKP1）高表达和低表达组的基因突变情况（a、b：肾乳头状细胞癌中SKP1高表达、低表达；c、d：肾透明细胞癌中SKP1高表达、低表达；e、f：肾嫌色细胞癌中SKP1高表达、低表达）

图2 肾癌中S期激酶相关蛋白2（SKP2）高表达和低表达组的基因突变情况（a、b：肾乳头状细胞癌中SKP2高表达、低表达；c、d：肾透明细胞癌中SKP2高表达、低表达；e、f：肾嫌色细胞癌中SKP2高表达、低表达）

2.6 肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌SKP2相关的共表达基因分析 使用Metascape（http://metascape.org/）数据库分析这3种肾癌中SKP2共表达基因的细胞生物功能富集分析，结果显示SKP2与RNA定位、DNA复制、核糖核蛋白复合物生物发生、mRNA代谢过程、细胞周期、中心体循环、染色质结合、转移酶复合物、组蛋白修饰、有丝分裂细胞周期过程、DNA修复、微管细胞骨架组织、细胞周期过程的调节、染色体组织的调节、DNA构象改变等功能相关。SKP2共表达基因之间在蛋白质水平上存在密切相互作用。

3 讨论

肾癌对化疗和放疗敏感性较低，靶向治疗多数均会出现耐药，免疫治疗以及免疫联合靶向治疗成为目前的治疗热点，但不同个体间疗效差异大。迄今为止，肾癌仍然缺乏简单的、有助早期诊断、指导治疗和预测预后的生物标志物。泛素蛋白酶体系统（UPS）主要调控蛋白质的稳定性和活性，进而影响细胞增殖、细胞周期进程、转录、凋亡、衰老、自噬等多种细胞功能，并调控免疫检查点分子的表达以及免疫细胞的成熟，参与肿瘤微环境的塑造等[7-8，11]。SKP2是F-box蛋白的一种，它与Cullin-1、SKP1和Rbx1一起形成SCFE3泛素连接酶复合体，是该复合体的基质识别亚单位。E3泛素连接酶功能的获得或丧失，会导致癌蛋白或肿瘤抑制因子的异常降解，可能导致肿瘤发生和其他疾病，而F-box蛋白的致癌和抑癌功能取决于其泛素底物的生物学功能[8,11]。研究报道过高SKP2表达可以导致细胞的过度生长和各种肿瘤的生成，SKP2过表达见于多种人类肿瘤并与不良预后和治疗效果差相关，抑制SKP2成为抗肿瘤治疗方法之一[9-10，19]。SKP1在多种肿瘤和正常组织中表达存在明显差异，SKP1表达异常与染色体不稳定性相关，可能参与肿瘤发生过程，对其机制的深入研究有助于进一步明确其对肿瘤预后的预测价值或作为治疗目标的意义[14]。

本研究分析了SKP1、SKP2表达水平对3种肾癌患者预后的影响。结果表明，与正常组织比较，SKP1基因表达水平在3种肾癌组织中均降低，SKP2基因表达水平在肾透明细胞癌和肾乳头状细胞癌组织中升高。SKP1表达高低与预后的关系在这3种肾癌中均不同。而SKP2高表达者在肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌和肾乳头状细胞癌中的生存期均较低表达者明显缩短。SKP2在肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌和肾嫌色细胞癌中预测生存的AUC值多数为0.6～0.7、0.7～0.8、0.8～0.9，一致性指数分别维持在0.6、0.6～0.7和0.8左右，预测准确性相对稳定。本研究结果表明，SKP2是肾癌预后不良的重要因素。

本研究进一步分析了肾癌中SKP1和SKP2表达水平的影响因素，结果显示其表达水平与临床病理特征以及甲基化位点等相关。ch.5.2450351R、cg19957803、cg04691829、cg20261922、cg00854995、cg26922706、cg04136748等7个甲基化位点与这3种肾癌SKP1表达水平均显著相关。cg04696559与肾乳头状细胞癌和肾透明细胞癌的SKP2表达水平显著相关。对于SKP1或SKP2甲基化位点，肾乳头状细胞癌中有17个，肾嫌色细胞癌中12个，肾透明细胞癌中23个与总生存期相关。说明SKP1和SKP2甲基化位点也可以成为肾癌的预后预测因子。

除了SKP1和SKP2的表达谱外，本研究还分析了其基因突变情况。发现肾透明细胞癌中SKP1和SKP2突变占14%。KMT2C、HERC2、PRKDC、SETD2和HMCN1这5种基因突变与肾癌中SKP1或SKP2表达高低相关。其中前4种基因均和DNA损伤修复和基因组不稳定相关，参与免疫应答，可能影响免疫治疗效果和预后。而HMCN1在细胞连接中起稳定作用，参与调节细胞侵袭和肿瘤转移。其中KMT2C具有组蛋白H3K4赖氨酸特异性甲基化活性，参与基因的表观遗传修饰，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控，导致染色质重塑和调控基因表达，其功能主要通过影响增强子和启动子之间的交流来实现。KMT2C缺失影响DNA损伤修复相关基因的表达。有研究报道KMT2C突变或KMT2C mRNA水平较低的乳腺癌样本的肿瘤突变负荷升高。SETD2能特异性催化组蛋白H3第36位赖氨酸的三甲基化。肾透明细胞癌中SETD2突变与广泛DNA低甲基化、RNA处理障碍和染色体结构暴露相关[20-24]。SETD1A通过调控有丝分裂基因启动子上的H3K4甲基化，维持了细胞内有丝分裂过程的完整性。SETD1A敲除可诱导细胞衰老，而其中SKP2与细胞周期阻滞相关。Akt通过SETDB1进行K64甲基化，组蛋白去甲基化酶JMJD2A可以识别Akt K64甲基化并招募SKP2-SCF到Akt复合物，启动K63连接的泛素化、细胞膜募集和Akt的激活。在非小细胞肺癌中，SETDB1介导的Akt K64甲基化上调并与Akt过度活化相关，促进肿瘤发展并预测不良预后。由SETDB1介导的Akt k64甲基化协调的Akt激活调控，驱动肿瘤发生[25-26]。肾癌中SETD2、KMT2C突变和SKP1、SKP2表达以及甲基化调节之间的具体机制需要进一步研究明确。

研究报道，SKP2可以通过影响E钙黏蛋白、CKIs、FOXM1、FOXO1、p21、p27、p57、基质金属蛋白酶9蛋白表达水平、p300等调节细胞周期进程，影响细胞凋亡和DNA损伤，改变细胞的迁移和侵袭能力等，并可促进癌细胞的糖酵解，调节肿瘤干细胞的分化等影响肿瘤发生转移和复发等[8，11，27]。SKP2 还与多种抗肿瘤药物的耐药性相关。研究报道，泛素-蛋白酶体系统E3连接酶通过干扰细胞增殖和细胞周期、转录、凋亡、细胞有丝分裂和纺锤体组装等促进耐药性。SKP2抑制可以使鼻咽癌、前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤对传统的抗癌药物敏感，包括紫杉醇、顺铂、赫赛汀等[10，28-31]。本研究结果显示肾癌中SKP2共表达基因与细胞增殖、细胞周期、细胞代谢、DNA修复等细胞功能相关，而这些均参与免疫应答调节。

另外，泛素化系统可以调控免疫细胞的成熟和免疫检查分子的表达，参与肿瘤微环境的塑造[5-7]。肿瘤微环境由巨噬细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突细胞、中性粒细胞和髓源性抑制细胞等组成，在肿瘤发生、发展中起关键作用[32]。研究报道在肾透明细胞癌中CD8细胞毒性T细胞浸润的程度与生存获益呈负相关，这可能与其T细胞功能障碍特征相关[33-34]。最新研究表明，当黑色素瘤、软组织肉瘤和肾细胞癌等肿瘤内出现B细胞和三级淋巴结构这两个关键要素时，癌症患者接受免疫治疗会有更好的效果[35-38]。因此，笔者推测泛素化系统在肿瘤的免疫调节及免疫治疗效果中可能具有重要作用。

总之，SKP2是肾癌预后不良的独立预测因子。KMT2C、HERC2、PRKDC、SETD2和HMCN1这5种基因突变与肾癌中SKP1或SKP2表达高低相关。SKP1或SKP2多个甲基化位点与肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌预后相关。肾癌中SKP2共表达基因部分富集于细胞增殖、细胞周期、细胞代谢、DNA修复等细胞功能，这些均与免疫应答调节相关。