声带白斑组织SMAD4、IL-35的表达及其与喉癌的关系研究

孙瑶 李彦 凌恺 郑丹丹 司马国旗

声带白斑表现为声带黏膜白色斑或斑片状改变，可有增生、化生和不典型增生等上皮样改变，约6%～22%的患者可能发展为喉癌，被认为是喉癌的癌前病变之一[1-2]。因此，临床上早期诊断声带白斑意义重大。研究发现，果蝇母亲DPP同源物4（drosophila mothers against decapentaplegic protein 4,SMAD4）、IL-35作为转化生长因子 β（transforming growth factor β,TGF-β）信号的中枢介质及免疫调节因子，是头颈部鳞状细胞上皮肿瘤发生、发展的重要预测指标[3]。基于此，本研究对比分析 SMAD4、IL-35[包括2个亚型：IL-12p35、EB病毒诱导蛋白 3（Epstein-Barr virus induced 3,Ebi3）]在声带息肉、白斑及喉癌组织中的表达情况，并探讨其与喉癌的关系，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2019年1月至2021年1月嘉兴市第一医院耳鼻咽喉科收治的行手术治疗的声带白斑患者30例为声带白斑组，声带息肉患者30例为声带息肉组，喉癌患者30例为喉癌组。纳入标准：（1）病理学检查确诊为声带息肉、声带白斑或喉癌；（2）病变均为单侧声带，病历资料完整；（3）无其他系统恶性肿瘤病史；（4）无头颈部放疗史；（5）无咽部手术治疗史。声带白斑组男27例，女3例，年龄（45.37±8.43）岁；Ⅰ型（光滑平坦型）占63.3%（19/30），Ⅱ型（光滑肥厚型）占16.7%（5/30），Ⅲ型（粗糙型）占20.0%（6/30）。声带息肉组男14例，女16例；年龄（40.78±9.31）岁。喉癌组男29例，女1例，年龄（59.33±7.63）岁。3组患者性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。3组患者均由同一团队医师完成手术及后续的治疗随访。声带息肉组患者手术方式均为支撑喉镜下声带息肉切除术，声带白斑组患者手术方式均为支撑喉镜下CO2激光声带白斑切除术，喉癌组患者手术方式均为喉部分切除+功能性颈淋巴结清扫术。声带白斑组患者术后随访12～35（35.6±5.9）个月，术后复发7例，其中进展为喉癌2例，其余患者无殊。喉癌组患者术后随访16～38（29.7±8.3）个月，喉癌局部复发2例，无远处转移。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 组织标本取材与RT-PCR检测样本制备 声带息肉、白斑、喉癌组织取材均与病理科取材同步进行，保存于-80℃深低温冰箱中。RT-PCR检测时取适量组织置入研磨器中，加入1 ml Trizol裂解液（上海联迈生物工程有限公司）后置于冰上充分研磨后转至洁净的1.5 ml EP管中，室温静置5 min后在4℃下以12 000 r/min离心5 min，取上清液置于洁净的EP管内备用。

1.2.2 声带息肉、白斑、喉癌组织SMAD4、IL-35 mRNA表达水平检测 采用RT-PCR法。提取组织总RNA，取2 μl RNA溶液在核酸测定仪（山东高芯生物传感器研究院有限公司）中检测OD260/280值，测定RNA浓度，于-80℃保存。将1 μl RNA溶液及逆转录试剂盒置入冰上融化，70℃水浴中孵育5 min，低速离心后42℃60 min，70℃10 min上机行逆转录，合成cDNA第一链，反应产物置于-80℃条件下保存备用。SYBR®Green Realtime PCR Master Mix反应体系，95℃变性60 s，95℃退火15 s，60℃延伸15 s，共40个循环。PCR扩增反应后绘制熔解曲线，运用MJ Opticon Monitor 3.0分析软件计算得Ct值，然后以GAPDH mRNA作为内参进行标准化，最后计算各组织RNA相对表达水平。

1.2.3 声带息肉、白斑、喉癌组织SMAD4、IL-12p35、Ebi3蛋白表达定性检测 采用免疫荧光染色法，经烤片、脱蜡、抗原修复、一抗结合、滴加二抗、DAB显色、苏木素复染、乙醇溶液脱水干燥等步骤，以细胞膜、细胞质出现明确的黄色或黄褐色颗粒为阳性细胞。细胞阳性率评分：阳性细胞＜5%计0分；5%～＜25%计1分；25%～＜50%计2分；50%～＜75%计3分；≥75%计4分；细胞染色强度评分：不染色计0分；淡黄色计1分；棕黄色计2分；棕褐色计3分。两项评分的乘积作为各蛋白表达的定性结果：0～2分为阴性（-），3～5分为弱阳性（+），6～8分为中度阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。+～+++都归为阳性表达。

1.3 观察指标 （1）比较声带息肉、白斑、喉癌组织SMAD4、IL-12p35、Ebi3 mRNA表达水平；（2）比较声带息肉、白斑、喉癌组织SMAD4、IL-12p35、Ebi3蛋白表达情况；（3）分析声带组织SMAD4、IL-12p35、Ebi3 mRNA表达水平、蛋白阳性表达率与上皮异常增生程度（包括声带息肉、声带白斑、喉癌）的相关性；（4）分析声带白斑术后发展为喉癌的危险因素；（5）分析影响喉癌患者预后的危险因素。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验，组间两两比较采用χ2分割法。相关性分析采用Spearman秩相关。危险因素分析采用Cox多因素分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 声带息肉、白斑、喉癌组织SMAD4、IL-12p35、Ebi3 mRNA表达水平比较 声带息肉、白斑、喉癌组织SMAD4、IL-12p35、Ebi3 mRNA表达水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。组间两两比较，声带息肉组织SMAD4 mRNA表达水平＞声带白斑组织＞喉癌组织（均P＜0.05）；声带息肉组织IL-12p35 mRNA表达水平＜声带白斑组织＜喉癌组织（均P＜0.05）；声带息肉组织Ebi3 mRNA表达水平＜声带白斑组织＜喉癌组织（均P＜0.05）。见表1。

表1 声带息肉、白斑、喉癌组织SMAD4、IL-12p35、Ebi3 mRNA表达水平比较

2.2 声带息肉、白斑、喉癌组织SMAD4、IL-12p35、Ebi3蛋白表达情况比较 在声带息肉组织中有大量SMAD4阳性表达细胞，随着上皮异常增生程度的加重，声带白斑组织及喉癌组织中SMAD4阳性表达细胞显著减少；在声带息肉组织中有少许IL-12p35及Ebi3阳性表达细胞，主要集中在基底膜，随着上皮异常增生程度的加重，声带白斑及喉癌组织中IL-12p35、Ebi3阳性表达细胞显著增加，见图1-3（插页）。声带息肉、声带白斑、喉癌组织SMAD4阳性表达率比较差异有统计学意义（P＜0.05），声带息肉组织＞声带白斑组织＞喉癌组织（均P＜0.05）；声带息肉组织、声带白斑组织、喉癌组织IL-12p35阳性表达率比较差异有统计学意义（P＜0.05），声带息肉组织＜声带白斑组织＜喉癌组织（均P＜0.05）；声带息肉组织、声带白斑组织、喉癌组织Ebi3阳性表达率比较差异有统计学意义（P＜0.05），声带息肉组织＜声带白斑组织＜喉癌组织（均P＜0.05）。见表2。

图1 声带息肉、白斑、喉癌组织中果蝇母亲DPP同源物4（SMAD4）的表达（a：声带息肉组织；b：声带白斑组织；c：喉癌组织；免疫荧光染色，×400）

图2 声带息肉、白斑、喉癌组织中IL-12p35的表达（a：声带息肉组织；b：声带白斑组织；c：喉癌组织；免疫荧光染色，×400）

图3 声带息肉、白斑、喉癌组织中EB病毒诱导蛋白3（Ebi3）的表达（a：声带息肉组织；b：声带白斑组织；c：喉癌组织；免疫荧光染色，×400）

表2 声带息肉组织、声带白斑组织、喉癌组织SMAD4、IL-12p35、Ebi3蛋白阳性表达率比较[例（%）]

2.3 声带组织SMAD4、IL-12p35、Ebi3 mRNA表达水平、蛋白阳性表达率与上皮异常增生程度的相关性分析 声带组织SMAD4 mRNA表达水平、蛋白阳性表达率与声带组织上皮异常增生程度均呈负相关（rs=-0.637、-0.817，均P＜0.05）；IL-12p35 mRNA表达水平、蛋白阳性表达率与声带组织上皮异常增生程度均呈正相关（rs=0.712、0.673，均P＜0.05）；Ebi3 mRNA表达水平、蛋白阳性表达率与声带组织上皮异常增生程度均呈正相关（rs=0.681、0.776，均P＜0.05）。

2.4 声带白斑术后发展为喉癌的危险因素分析 Cox多因素分析显示，声带白斑形态分型差、上皮异常增生程度高、SMAD4低表达及Ebi3高表达是声带白斑术后发展为喉癌的独立危险因素（均P＜0.05），见表3。

表3 声带白斑术后发展为喉癌的危险因素分析

2.5 影响喉癌患者预后的危险因素分析 Cox单因素分析显示，肿瘤T分期、肿瘤组织分化程度低、淋巴结转移、脉管转移、SMAD4低表达及IL-35高表达是影响喉癌患者预后的危险因素（均P＜0.05）；多因素分析显示，淋巴结转移及IL-35高表达是影响喉癌患者预后的独立危险因素（均P＜0.05），见表4。

表4 影响喉癌患者预后的危险因素分析

3 讨论

声带白斑是指发生于声带黏膜，表现为白色斑块状或者隆起的病变，但该术语仅为临床上的一种形态学描述性诊断。以往在临床上把声带白斑等同于癌前病变，但这一观点尚有争议，不少学者认为声带白斑仅是临床描述性名词，本身并不提示某种组织病理学变化，更并非癌或者恶性病变的代名[4-5]。由于声带白斑的病因复杂，病理分类、治疗与随访策略尚缺乏统一标准，但因其具有一定的恶变潜能，故临床上备受关注。Mehanna等[6]研究表明声带白斑中病理学、基因分析、生物标志物预测等是未来研究方向，但有关声带白斑基因、分子生物学等方面研究却鲜见文献报道。

正常声带黏膜组织转变为声带白斑甚至进一步癌变为喉癌的过程也是多因素造成的，包含细胞凋亡调控、信号转导、细胞迁移黏附、癌基因与抑癌基因、DNA损伤修复等多个生物过程。SMAD4作为一种抑瘤基因，是转导TGF-β信号的重要胞质内信号级联分子，并负责将信号转导至细胞核，发挥转录因子的功能，当SMAD4表达障碍时，可能导致肿瘤发生、发展[7]。本研究结果显示，SMAD4在声带息肉组织、声带白斑组织、喉癌组织中表达依次下调且其表达强度与上皮异常增生程度呈负相关，同时多因素分析也表明SMAD4低表达是声带白斑术后发展为喉癌的独立性危险因素。Junki等[8]研究也发现SMAD4在口腔白斑恶变存在预测价值，其可能的机制是SMAD4通过基因突变、缺失或表达静止导致功能失活，并在肿瘤的发生、发展中起重要作用。由此说明，SMAD4的低表达可能通过阻断TGF-β等信号通路，减少相关抑癌基因表达而导致声带白斑的恶变，并可能预测声带白斑的术后转归。

肿瘤的发生、发展与机体的免疫状态密切相关，当机体免疫功能低下或免疫功能受到抑制时，调节性T细胞（Treg）会诱导肿瘤细胞通过免疫逃逸机制逃避效应细胞的识别和杀伤，最终导致肿瘤的发生、发展[9]。IL-35是新发现的、具有免疫抑制功能的细胞因子，主要由Treg产生，可显著抑制效应T细胞（Teffs）增殖并促进Treg增殖参与肿瘤微环境而发挥免疫抑制作用，与肿瘤进展及肿瘤预后不良有关，主要有2个亚基：Ebi3、IL-12p35。Collison等[10]研究显示，鼻咽癌肿瘤组织中Ebi3、IL-12p35的表达明显高于癌旁组织及鼻咽部慢性炎症组织，且其表达程度与肿瘤临床分期、组织学分型和颈部淋巴结转移密切相关。本研究中，Ebi3、IL-12p35在声带息肉组织、声带白斑组织及喉癌组织中表达依次上调且其表达强度与上皮异常增生程度呈正相关，这说明IL-35与喉癌的发生、发展进程呈正相关，其免疫抑制作用出现在喉癌发生的早期阶段，随着喉癌进展，肿瘤细胞进一步失去正常机体免疫识别调控及清除，IL-35的高表达加速细胞无限增殖，影响喉癌患者预后。

Young等[11]研究表明喉镜下检查观察到的白斑病损的颜色、充血（合并红斑）、大小、质地与白斑组织病理类型存在一定的相关性，可作为制定治疗方案或手术方式前的评估项目。本研究表明，声带白斑形态分型是声带白斑术后发展为喉癌的独立危险因素，Ⅲ型患者更易发展为喉癌。Fang等[12]研究也表明，喉镜下声带白斑不同分型的病理类型是存在差异的，白斑的形态分型等级越高，其病理异型增生程度越高。但目前国内外均没有成体系的声带白斑的分类、分级或分期的研究报道。故笔者认为，声带白斑形态分型是影响预后的客观指标，但需结合声带上皮异型增生程度的病理类型来评估患者预后。

综上所述，SMAD4的低表达及IL-35的高表达可能通过阻碍细胞信号通路或调节免疫抑制影响声带白斑的转归，并可能成为喉癌的发生、发展的早期事件。SMAD4、IL-35有望成为预测声带白斑转归乃至喉癌预后的重要靶点或标志物，但具体作用机制尚有待进一步研究。