Box-Behnken响应面法优化壮药三角泡中黄酮成分提取工艺及抗氧化作用研究

李 澄，黄文婧，廖 强，郭振旺

（1.广西国际壮医医院，广西 南宁 530000；2.广西艾为科技有限公司，广西 南宁 530000；3.南宁市食品药品检验所，广西 南宁 530000；4.广西中医学校，广西 南宁 530000）

三角泡为无患子科植物倒地铃Cardiosperminum halicacabum Linn.的干燥全草，壮药名为棵灯笼Godaengloengz。壮医认为三角泡具有清热毒、除湿毒、通气道的功效，主要用于治疗货烟妈（咽炎）等症[1]。现代研究[2]表明，三角泡中含有多种黄酮类成分，如槲皮素、木犀草素、芹菜素、金圣草黄素等。综合文献[3-4]分析，三角泡治疗货烟妈（咽炎）的功效，可能与其黄酮类成分通过调节氧化应激，从而抑制炎性介质的产生有关。鉴于此，本研究以三角泡中槲皮素、木犀草素、芹菜素3种黄酮类成分的含量为考察指标，采用Box-Behnken响应面法，优化提取工艺，并对获得的提取物进行抗氧化作用研究，以期为壮药三角泡的开发应用打下基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器Waters e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；XS-205型电子天平（瑞士梅特勒公司）；Multiskan Go型全波长酶标仪（美国赛默飞公司）。

1.2 试药槲皮素（批号：100081-200904）、木犀草素（批号：111520-201605）、芹菜素（批号：111901-201603）均购自中国食品药品检定研究院；三角泡采自广西武鸣县大明山，经南宁市食品药品检验所廖强副主任中药师鉴定为无患子科植物倒地铃Cardiosperminum halicacabum Linn.的干燥全草；2，2-二苯基-1-苦肼基（DPPH）（批号：D807297）、2，2-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨盐（ABTS）（批号：A800764）均购自麦克林公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Agilent Zorbox SB-C18柱（4.6 mm×250mm，5μm），线性梯度洗脱，洗脱程序见表1；流速为1mL/min；检测波长为350 nm；柱温为25℃；进样量为10 μL。相关色谱图见图1。

图1 HPLC图

表1 梯度洗脱条件

2.2混合对照品溶液的制备 取槲皮素43.3 mg、木犀草素27.4mg、芹菜素24.1mg，配置成质量浓度分别为0.866 0、0.548 0、0.4820mg/mL的混合对照品贮备液。取混合对照品贮备液1.0 mL，稀释，即得含槲皮素（86.60 μg/mL）、木犀草素（54.80 μg/mL）、芹菜素（48.20 μg/mL）的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备取三角泡药材粉末1.0 g，置25 mL容量瓶中，加甲醇超声提取20 min，过滤，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 取“2.2”项下混合对照品溶液0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，测定，得回归方程及线性范围。（见表2）

表2 回归方程及线性范围

2.4.2 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样6次，记录各色谱峰峰面积，计算得槲皮素、芹菜素、木犀草素峰面积的RSD值分别为0.56%、0.68%、0.45%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12 h进样，记录色谱峰，计算得槲皮素、芹菜素、木犀草素峰面积的RSD值分别为1.12%、0.98%、1.35%，表明供试品稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液6份，进样测定，计算得槲皮素、芹菜素、木犀草素含量分别为2.18、1.42、0.97 mg/g，RSD值分别为1.21%、1.02%、0.87%，表明本试验重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 取已知含量的三角泡样品6份，每份0.5 g，置25 mL容量瓶中，加混合对照品贮备液1.5 mL，计算加样回收率。结果见表3。

表3 加样回收率试验结果

续表3：

2.5 响应面法优化三角泡提取工艺

2.5.1 试验设计方案与试验结果 根据预实验的初步结果，以乙醇浓度、料液比、提取时间及提取温度为主要考察因素，分别用X1、X2、X3、X4来表示，并以1、0、-1分别表示自变量的高低水平，分别以槲皮素、芹菜素、木犀草素的总提取值为响应值。设计的试验因素和水平取值见表4。

2.5.2 模型建立与显著性检验 利用Design expert 10.0.4软件对四因素三水平共27个试验点进行编码，见表5。

表5 BBD实验设计与结果

续表5：

根据表5的结果，进行多元二次回归分析，二次模型中回归系数的显著性检验见表6。方差的结果分析，模型的显著性值P＜0.000 1，表示二次多项模型高度显著，可充分代表响应值（总提取值）与4个变量X1、X2、X3、X4的关系。根据ANOVA的分析表明总提取值的决定系数R2为93.43%，模型F值为12.20，表明模型拟合度良好。从表6可以看出，X1、X2、X3、X4均为极显著水平（P＜0.01），根据比较F值，表明各因素对三角泡提取的影响程度依次为X2＞X4＞X3＞X1，交互项对提取值的影响依次为X2X4、X1X2、X1X3、X1X4、X3X4、X2X3。各试验因子对响应值的影响呈显著的线性关系，回归方程分别为：

表6 变量与响应值方差分析

2.5.3 响应面分析与优化 为说明交互项中乙醇浓度与料液比（X1X2）、乙醇浓度与提取时间（X1X3）、乙醇浓度与提取温度（X1X4）、料液比与提取时间（X2X3）、料液比与提取温度（X2X4）、提取时间与提取温度（X3X4）的交互作用对三角泡中3种黄酮类成分的总提取值的影响，绘制响应面图和等高线图，响应曲面越陡说明各因素之间的相互作用越显著，对提取值的影响依次为X2X4＞X1X2＞X1X3＞X1X4=X3X4＞X2X3。（见图2）

图2 X1、X2、X3、X4交互影响对三角泡总提取值的响应曲面图和等高线图

2.5.4 验证试验 软件预测最佳因素条件为乙醇浓度80.00%，料液比1∶37.49，提取时间41.18 min，提取温度68.36℃，在此条件下三角泡中槲皮素、木犀草素和芹菜素的总提取值为4.315 mg/g。为方便进行验证试验，修正为乙醇浓度80%，料液比1∶37，提取时间40 min，提取温度68℃。平行提取3份药材，总提取值分别为4.324、4.316、4.278 mg/g，平均值为4.306 mg/g，偏差为0.21%，表明实测值和预测值拟合较好。

2.6 抗氧化试验与结果

2.6.1 三角泡提取物制备 三角泡药材粉碎，过20目筛样品粉末10 g，按照“2.5.4”项下条件提取，减压抽滤，蒸干，备用。

2.6.2 DPPH清除自由基能力 取DPPH 25.4 mg，无水乙醇溶解至100 mL，备用，使用时再稀释10倍；样品浓度设置为5个梯度（20、40、60、80、100 mg/mL），将每种供试品溶液分别取20 μL加样到96孔板中，再在每个孔中平行加入180 μL DPPH溶液。同时设立对照组、空白组。避光反应30 min。在波长515 nm处测定。

2.6.3 ABTS+自由基清除能力 配制3 mL的7 mmol/L ABTS和3 mL的2.45 mmol/L过硫酸钾溶液混合，避光过夜，得到ABTS+自由基储备液。使用前加70%乙醇调至吸光度为0.700±0.005，在96孔板中每孔加入40 μL的样品，样品设置5个浓度（20、40、60、80、100 mg/mL），再加入160 μL ABTS+自由基工作液，以200 μL 70%乙醇为空白，混合10 s，避光静置6 min，734 nm波长测定。

2.6.4 羟基自由基清除能力[5-6]采用Fenton反应，其机制为H2O2与Fe2+反应产生·OH，在该体系中加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质，抗氧化物清除·OH而使体系颜色变浅，可间接检测·OH含量。取20、40、60、80、100 mg/mL样品溶液各400 μL，依次加入9.0 mmol/L FeSO4溶液、9.0 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、8.8 mmol/L H2O2溶液各200 μL，混匀后37℃静置30 min，在510 nm波长处测定吸光度，以蒸馏水作空白组。

2.6.5 抗氧化结果 清除率的计算公式：清除率=[1-(A给药-A空白)/A对照]×100%。

结果表明，三角泡提取物清除DPPH及ABTS+自由基的能力均与浓度有剂量依赖性，浓度越高，清除能力越强，清除DPPH自由基、ABTS+自由基及羟基自由基的IC50值分别为46.99、45.72、44.21 mg/mL。（见图3）

图3 三角泡提取物对DPPH、ABTS+及羟基自由基的清除能力比较

3 讨 论

若以单一成分作为提取工艺的检测指标，对药物活性成分的检测则较为片面，得到的提取物可能导致某些活性成分的缺失。以多个成分为检测指标，可以较为全面地将药材中发挥药效作用的物质尽可能多的纳入考察范围内，可提高提取物中活性成分的含量及精准性[7-9]。本研究主要是围绕壮药三角泡中黄酮类成分的提取来制定提取工艺方法，除了选择3个黄酮类成分作为考核指标外，还增加了总提取值来进行综合考察，力求能单一成分及综合成分兼顾，来提高评价指标的客观性。

中草药中活性成分的提取工艺研究常用的方法有正交设计法、响应面分析法，两种方法都具有试验次数少、周期短的特点，但是相比之下，响应面分析法能更好地研究各因素之间的交互作用。此外，响应面分析法在对试验结果进行分析时，可通过做出响应面图及其等高线，得到两个因素的交互影响作用及各因素的最佳范围，利用线性关系回归方程，确定在试验范围内的任何试验点的预测值[10-13]。本研究预测最佳因素条件为乙醇浓度80.00%，料液比1∶37.49，提取时间41.18 min，提取温度68.36℃，在此条件下三角泡中槲皮素、木犀草素和芹菜素的总提取值为4.134 mg/g。验证试验结果总提取值分别为4.324、4.316、4.278 mg/g，平均值为4.306 mg/g，偏差为0.21%，证明该工艺稳定，重现性好。

酚类化合物是常见的抗氧化剂，酚类化合物抗氧化的原理主要是通过酚羟基的抽氢反应直接清除自由基[14-16]。黄酮类化合物是具有酚羟基结构的一类化合物，其多种药理活性均有可能是其酚羟基通过抗氧化活性而产生效应[17-20]。为了验证三角泡中黄酮类成分的抗氧化活性，本研究对三角泡提取物的抗氧化活性进行了研究。三角泡提取物清除DPPH及ABTS+自由基的能力均与浓度呈剂量依赖性，浓度越高，清除能力越强。其清除DPPH自由基、ABTS+自由基及羟基自由基的IC50值分别为46.99、45.72、44.21 mg/mL，结果表明三角泡提取物具有一定的抗氧化活性，其黄酮类化合物应为其抗氧化活性成分之一。