miRNA 序列及其靶基因结合位点的单核苷酸多态性对畜禽生产性状调控的研究进展

郭思玮，张馨心，张聪聪，张珈溯，尹宝珍，张洛萌，夏广军

（延边大学农学院，吉林延吉 133002）

畜禽的产仔量、精液品质、肌内脂肪沉积能力等生产性状受多基因遗传因素影响。microRNA（miRNA）是基因表达的关键调控因子，几乎参与调控生物整个生命过程，包括胚胎发育、染色体结构、细胞增殖、凋亡、应激抵抗、脂肪代谢和干细胞修复。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是基因组水平上的突变所引起的DNA 序列多态性，而miRNA 与靶基因结合位点单核苷酸多态性已引起研究者的关注。在畜牧业生产中，SNP 广泛用于筛选对畜禽有利的主效基因以改善相关性状，当miRNA 序列或其靶位点存在SNP，会影响miRNA 表达或其与靶基因的相互作用。营养调控和分子育种是改良畜禽品种品质的两大手段，在分子育种方面，目前研究较多的遗传标记技术包括限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增DNA 多态性（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）、单核苷酸多态性（SNP）、单链构象多态性（SSCP）等，但利用miRNA 的调控作用来提高畜禽产品品质方面研究相对较少。本文总结了近年来与miRNA 相关SNP 对畜禽生产性状影响的研究进展并对其未来发展进行展望，为培育具有优良生产性状的畜禽品种提供理论基础。

1 miRNA 生理特性

miRNA 是一类长度约为23 个核苷酸的非编码RNA，广泛分布于病毒、植物、原生生物和动物中，其功能是介导转录后基因沉默。1993 年，Lee 在秀丽隐杆线虫中首次发现miRNA，其在动植物基因表达中发挥重要的调节作用。miRNA 的生物发生是通过RNA 聚合酶II 转录启动开始的，首先转录生成miRNA 的原始转录产物pri-miRNA，pri-miRNA 在核内经Drosha 酶及其辅因子DGCR8 形成的复合体作用下，生成长度为60～70 bp 的发夹状miRNA 前体，最后形成长度约22 个核苷酸的双链RNA，双链解旋生成成熟的miRNA。miRNA 与mRNA 结合对调控mRNA和蛋白表达水平至关重要，大量的蛋白质编码基因是由miRNA 调节，由此可见与miRNA 相关的SNP 在调控各种生物功能方面起着重要作用。

2 miRNA 序列及其靶基因结合位点SNP

SNP 是指由于基因中单个碱基发生转换、缺失、插入或者颠换引起基因组DNA 序列的多态性，普遍存在于各种生物基因中。近10 年来，DNA 分子标记的研究和应用飞速发展，一系列DNA 分子标记系统相继形成。在众多分子标记中，SNP 标记是当前遗传标记研究中应用最多，也是最有前景的分子标记。miRNA 调控途径中的多态性是动物基因组中存在的一类新型功能性多态，但由于miRNA 生物发生的复杂性和miRNA 全基因组的功能效应，miRNA SNPs 的生物学作用仍然难以确定。

与miRNA 相关的多态性可分为两类：miRNA转录过程中的SNP（初始miRNA 和miRNA 前体的SNP）和miRNA 靶基因结合位点的多态性。一般来说，在miRNA 转录过程中，包括初始miRNA（pri-miRNA）、miRNA 前体（pre-miRNA）和成熟的miRNA 在内都有可能发生序列变化，这种多态性可能影响数百个基因和通路的表达，并且广泛影响miRNA 功能以及miRNA的加工或靶位点的选择。根据miRNA 序列中的SNPs，有3 种干扰miRNA 功能的渠道：pri-miRNA 或pre-miRNA 的突变可能会影响miRNA 稳定性或转录效率；在pri-miRNA 启动子区域的突变可能会影响转录速率；成熟miRNA 序列改变会破坏其与mRNA 靶位点的互相作用。与miRNA 转录过程中的多态性相比，靶基因3'UTR 区的序列变化在人类基因组中更为丰富。3'UTR 区是一个关键的控制区域，具有调节mRNA 稳定性、翻译和定位的能力。而miRNA 靶位点内的SNP仅影响靶mRNA 及其下游效应物，因此更具特异性。

miRNA 通常通过靶向mRNA3'UTR 区的部分互补序列来抑制基因表达，然而这种结合可能受到miRNA靶位点的SNP 影响，SNP 会破坏或产生新的结合位点。Luo 等证明位于基因3'UTR 区microRNA-7结合位点内的单核苷酸多态性（1010A/G），主要通过microRNA-7 的差异结合活性和与单核苷酸多态性相关的mRNA 稳定性影响基因在膀胱癌中的表达。hsa-miR-422a 靶基因在其靶位点3'UTR 的SNP rs12607853 与海洛因成瘾显著相关，hsa-miR-1270以等位基因特异性方式与SNP 位点的等位基因结合来抑制荧光素酶活性、与该基因3'UTR 中的SNP 结合来抑制基因的产生，还可通过靶向包含rs241456的T 等位基因的认知序列来调节基因的表达。探索与miRNA 相关的SNP 及其与表型性状间的关联有助于深入了解miRNA 的调控机制与功能。

3 miRNA 靶基因结合位点SNP 对畜禽生产性状的影响

3.1 miRNA 靶基因结合位点SNP 对肉质性状的调控 氧化低密度脂蛋白1（OLR1）是一类可以结合氧化低密度脂蛋白的受体，1997 年，Sawamura在牛主动脉内皮细胞中首次发现基因，属于C 型血凝素家族。有研究表明，基因参与脂质代谢与牛肉品质调控。张传生等研究发现bta-miR-370 靶标基因3'UTR 区存在1 个SNP 位点（A8232C），在奶牛基因3'UTR 发现bta-miR-370 因碱基不能互补配对而导致靶标缺失。李托研究发现秦川牛基因A>C 的突变导致bta-miR-370 的靶标缺失，抑制了其与基因mRNA 3'UTR 区结合且引起眼肌面积等肉质性状的变异。

3.2 miRNA 靶基因结合位点SNP 对产仔量的调控 干细胞因子（KITLG）是基因的配体，在原始生殖细胞的生长发育过程中起关键作用。基因通过触发其受体酪氨酸激酶，在生物的发育过程中具有多种生物学功能。An 等通过DNA 测序在山羊基因3'UTR 中发现3 个SNP 位点（c.1389C>T、c.1457A>C 和c.1520G>A），其中c.1457A >C 与山羊产仔数显著相关。荧光素酶检测结果证实chi-miR-204-5p 和chi-miR-211 与基因存在靶向关系，当等位基因C 存在时，chi-miR-204-5p 和chi-miR-211与基因结合被抑制，进而影响表达水平，这一发现有助于了解基因在山羊中的表达调节机制。

CDC42 是Rho GTPases 家族的一员，在控制细胞功能方面起着关键的调节作用。Liu 等发现猪基因3'UTR 区存在一个SNP 位点rs55618224（T>C），PCR-MnII-RFLP 检测显示在母猪胎盘中，CC 基因型基因mRNA 表达水平显著高于TT基因型。荧光素酶结果证实该位点是基因与miR-18a 结合位点，rs55618224 不仅影响miR-18a 与基因结合且与猪窝产仔数相关，这一研究结果为探索猪胎盘发育与改良母猪繁殖性状提供了新的思路。

An 等在山羊基因中发现g.151435C>T、g.151454A>G、g.173057T>C 3 个SNP 位点，g.151435C>T和g.173057T>C 与山羊产仔数显著相关。此外，g.173057T>C 多态位点可调控bta-miR-302a 与基因的结合活性，荧光素酶结果也证实该位点突变破坏了bta-miR-302a 与基因的结合。g.151435C>T与g.173057T>C 位点均可作为遗传标记，对山羊的遗传育种具有潜在应用价值。

3.3 miRNA 靶基因结合位点SNP 对产奶性状的调控 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是一种来自氧化还原酶类的酶，参与调节同型半胱氨酸浓度，MTHFR 是同型半胱氨酸再甲基化为蛋氨酸的必要原料。Hou以山羊为研究对象，在基因3'UTR区检测到2 个SNP 位点（g.2244A>G；g.2264A>G），这两处多态性与山羊的产奶性状相关。生物信息学分析与荧光素酶结果表明，hsa-miR-1266、hsa-miR-1289、hsa-miR-505 和hsa-miR-616 可以与基因3'UTR区结合，且2244A →G 突变可增加hsa-miR-1266 与基因3'UTR 的结合活性；2264A →G 突变可降低hsa-miR-616 与基因3'UTR 的结合活性。

Mahmoudi 等通过测序发现基因3'UTR 存在T14280C 突变。对3'UTR 区进行PCR 扩增和SSCP 检测后发现，该位点显著提高奶牛产后第5 天-羟基丁酸水平、体况评分以及牛奶中蛋白质含量。生物信息学分析显示，基因3'UTR 区存在mir-423-5p 靶位点，T14280C 突变使mir-423-5p 的靶标失活，而mi-423-5p 是在牛乳腺、肝脏和肾脏中表达最高的microRNA 之一，这一发现为mi-423-5p 在调节荷斯坦奶牛细胞代谢、代谢紊乱和牛奶品质方面有重要作用提供了科学依据。

脂肪酸去饱和酶2（FADS2）是参与长链多不饱和脂肪酸合成的限速酶。Li 等发现SNP 位点 c.1571G>A 通过破坏miR-744 与基因的结合能力，提高ω-6 长链多不饱和脂肪酸的合成，该位点是改善牛奶品质的潜在遗传标记。

3.4 miRNA 靶基因结合位点SNP 对精液品质的调控编码转化蛋白2（TNP2）与精子活力与精液品质相关，参与精子发生过程中核糖体的清除与精子细胞核的初始凝结。Gao 等在中国荷斯坦牛基因发现3个SNP 位 点（g.269 G.A,g.480 C.T,g.1536 C.T），关联分析表明3 个SNP 位点与中国荷斯坦牛精液品质性状显著相关。生物信息学分析预测，基因3'UTR中的g.1536 C.T 位点位于bta-miR-154 结合区域。荧光素酶检测进一步证实，bta-miR-154 靶向调节基因，而基因3'UTR 中的SNP（g.1536 C.T）破坏了基因与bta-miR-154 的结合，可作为哺乳动物精液质量与生育能力的辅助标记选择。

过渡核蛋白（TNPs）是浓缩精子细胞染色质中的主要蛋白质，Zhang 等发现基因3'UTR 区发现中2 个SNP 位点（g.442 A.G、g.528 G.A）与中国荷斯坦牛精液品质显著相关，生物信息学分析显示两个位点分别位于bta-miR-204 和bta-miR-532 与TNP1 结合区，荧光素酶结果进一步证实其靶向关系，这一发现对中国荷斯坦牛精液品质性状的选择有重要意义。

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）是一种多功能酶，在生殖生理过程中发挥重要作用。Huang 等研究发现基因的miRNA 结合位点上的SNP（c.+2183 G>T）与荷斯坦牛射精量、新鲜精子活力、寿命的基因组估计育种值、综合指数和产犊难易度的下降有关。荧光素酶检测结果显示，bta-miR-26a 抑制牛基因的表达，证实了bta-miR-26a 与的靶向关系，而多态位点可能通过破坏二者的结合对荷斯坦牛的精液质量产生影响。

3.5 miRNA 靶基因结合位点SNP 对其他生产性状的调控 胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2）属于IGFBPs 家族。基因在肝脏、脂肪细胞、生殖系统和中枢神经系统中广泛表达，对动物脂肪细胞的发育和脂质代谢有显著影响。Leng 等发现鸡体内基因3'UTR 区存在1 个SNP 位点（1196C>A）。于莹莹等通过实验证实鸡体内基因是gga-miR-456-3p 的靶基因，其3'UTR区的SNP（1196C>A）影响gga-miR-456-3p 对基因表达的调控。

热休克转录因子1（）基因在热应激反应中起关键作用。Li 等在中国荷斯坦奶牛基因3'UTR 区发现了1 个SNP 位点（g.4693G>T），该突变位点与中国荷斯坦奶牛的耐热性相关。荧光素酶分析表明，bta-miR-484 靶向调节基因，但由于多态性的存在与bta-miR-484 的结合活性受到抑制且对荷斯坦奶牛的耐热性产生影响。

综上所述，畜禽体内microRNA 靶基因结合位点的SNP 通过使其靶标缺失，靶基因不再受miRNA 调控，进而对各种生产性状产生影响。

4 miRNA 转录过程中的多态性对畜禽生产性状的影响

Wu 等通过Sanger 测序在3 个鸡品种的PCR 产物上发现初级miR-26a-5p 中的10 个SNP 位点，其中rs316365438（C>T）位点与首次卵龄和32 周产蛋总数相关。Wang 等发现位于miR-1666 前体区域内的突变位点rs14120863（C>G）与鸡8 周龄的胴体重、内脏重、胸肌重、腿部肌肉重显著相关，对成熟miR-1666 的生成也有显著影响。Li 等鉴定了位于鸡miRNA-1606前体的1 个SNP 位点，该位点与鸡第10 周、第12 周体重以及第8 周鸡腿长度、胸深以及体斜长显著相关，且改变了pre-mir-1606 的第二结构，成熟miRNA 在CA 基因型和AA 基因型之间的相对表达量在腿肌中也发生显著变化。

Cardoso 等在Nelore 牛不同miRNA 序列中（btamiR-2419-3p、bta-miR-193a-2 和bta-miR-1291）鉴定了3 个与脂肪酸组成显著相关的SNP 位点，其中位于bta-miR-1291 序列的多态位点与不同ω6 脂肪酸、多不饱和脂肪酸以及多不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值相关，另外2 个miR-SNPs 分别与月桂酸、顺式11-油酸以及6 亚麻酸、脂肪酸6/3 相关。

综上所述，miRNA 转录过程中的SNP 也会对畜禽的生产性状产生影响，可能成为动物育种中潜在的遗传标记用于分子辅助选择。

4 总结与展望

利用分子遗传标记技术改良畜禽生产性状已成为畜禽种质提升的重要手段，但目前对于miRNA 及其靶基因结合位点多态性的研究大多集中在医学方面，关于miRNA 序列及其靶基因结合位点对畜禽生产性状影响的研究也尚处起步阶段。现有对miRNA 及其靶位点的多态性与畜禽生产性状的研究局限在多态位点与生产性状的关联性分析及其与miRNA 相互作用，在今后的研究中应深入探索miRNA 及其靶位点多态性的调控网络和其复杂的转录后调控机制，找到与改进生产性状相关的分子机理，为培育具有优良生产性状的畜禽品种提供科学依据。