小鼠乳腺炎模型的建立及中草药防治研究进展

李 婷，范秋雨,2，李秀梅，刘魏魏，谢 飞，王秀敏*，戴小枫

（1.农业农村部饲料生物技术重点实验室，中国农业科学院饲料研究所，北京 100081；2.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206）

奶牛乳房炎即乳腺炎，是奶牛乳腺受到微生物感染、物理及化学等因素的刺激所诱发的一种炎症性反应。奶牛乳房炎一方面会造成产奶量急剧下降，另一方面会导致乳产品质量下降，不仅对奶牛养殖业造成严重的经济损失，甚至会危害到人类健康。目前，对奶牛乳房炎的发病机制及其复杂的临床发展过程尚不清楚，致使相关研究工作进展较为缓慢。科研人员需要通过构建乳房炎模型来对其进行相关研究，但直接在奶牛上进行实验研究费用较高，且无法进行标准化管理，这在一定程度上影响了对乳房炎的研究。目前，国内外科研人员通过建立小鼠乳腺炎疾病模型，对奶牛乳腺炎模型进行模拟以及研究其相关机理，小鼠乳腺炎模型具有耗时少、效率高及性价比高等优点，已被广大科研人员接受及采用。本文对小鼠乳腺炎模型的构建、中草药的防治机理及存在的问题等进行综述，以期为开发中草药防治奶牛乳腺炎提供理论参考。

1 小鼠乳腺炎疾病模型的建立

小鼠与奶牛的乳腺结构相类似，因此利用小鼠可以全面地模拟奶牛乳房炎的病因学、病理学和治疗学。研究表明，通过病原菌、脂多糖LPS、肠道菌群移植等方法成功建立了小鼠乳腺炎模型。

1.1 致病菌诱导的小鼠乳腺炎模型 据报道，导致奶牛发生乳腺炎的病原微生物达150 多种，包括接触传染性病原菌（如葡萄球菌、链球菌等）和环境性病原菌（如大肠杆菌、牛棒状杆菌等），其中，金黄色葡萄球菌、链球菌及大肠杆菌占80% 以上，已被成功地用于小鼠乳腺炎疾病模型的构建。

站永波在母鼠产后60 h 后与仔鼠分离，72 h 时在第4 对乳腺内灌注金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌悬液，结果显示，感染24 h 后小鼠腺泡结构被破坏，乳腺泡上皮细胞脱落、溶解坏死，出现中性粒细胞浸润和水肿，可见混合菌诱导了急性小鼠乳腺炎的发生。谢菲等在BALB/c 母鼠第4 对乳腺分别注入50 μL 细菌悬液（奶牛乳腺炎源金黄色葡萄球菌量为10～10CFU），结果显示，10CFU 攻菌组的小鼠乳腺炎发病率为100%，乳腺内细菌数量较多，乳腺组织出现病变，且未出现死亡现象。由此可知，金黄色葡萄球菌量为10CFU适于建立乳腺炎疾病模型。王莹对小鼠进行麻醉后，对第4 对乳房消毒，充分暴露乳头，剪去乳头最尖端0.5 mm，于乳房基部灌注金黄色葡萄球菌悬液，攻菌后，乳腺腺泡和小叶正常结构消失，乳腺组织细胞变性和坏死，大量乳腺上皮细胞脱落及存有炎性细胞浸润等；血清/组织中的炎性因子如白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-）、Toll 样受体2（TLR2）蛋白、核因子B（NF-B）/ 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路中关键蛋白的表达水平显著上调。可见金黄色葡萄球菌诱导了小鼠乳腺炎的发生。甘露等使用奶牛源地衣芽胞杆菌对小鼠乳腺组织进行感染，发现小鼠乳腺组织出现了明显的炎症症状，在腺泡腔内有大量的嗜中性粒细胞浸润；实验组中的热休克蛋白70（HSP70）和NF-B 表达量高于生理盐水组和空白组，这表明芽孢杆菌能够诱导小鼠乳腺炎的发生。徐进等将金黄色葡萄球菌注射到小鼠第4 对乳腺，结果显示，在模型组中，小鼠血清中的炎性因子如IL-6、TNF-和白细胞介素8（IL-8）显著上调，说明病原菌能够引起小鼠乳腺发生炎症反应，成功建立了小鼠乳腺炎模型。

无乳链球菌是导致奶牛患乳腺炎的主要致病菌之一，主要引起隐性乳腺炎或部分临床型乳腺炎。张进红等在母鼠第4 对乳房的乳池内分别注入50 μL 的10CFU无乳链球菌，12 h 后乳腺组织出现明显的脂肪变性、乳腺充血、间质水肿、炎性细胞浸润和腺泡间隔增宽等现象；48 h 后腺泡上皮大多坏死、脱落及消失，部分嗜中性粒细胞坏死崩解，白细胞介素4（IL-4）水平达到峰值；72 h 后腺体严重充血、出血，腺泡组织结构遭到严重破坏。刘雪松对小鼠腹腔注射1% 戊巴比妥钠（0.01 mL/g）进行麻醉后，对第4 对乳房消毒，并剪下一块乳房组织（长度<1 mm），将100 μL 浓度为5×10CFU/mL 无乳链球菌注射到小鼠第4 对乳腺内，攻菌72 h 后，小鼠乳腺腺泡中出现中性粒细胞浸润与腺泡壁水肿等病理变化。综上，无乳链球菌可诱导小鼠乳腺急性炎症的发生。

此外，大肠杆菌也是导致奶牛乳腺炎的主要环境性致病菌，是奶牛业生产中最难防治的疾病之一。安泓霏等在小鼠乳腺内灌注大肠杆菌O1128:K99:F41，发现在攻菌后第6 h，炎性因子TNF-表达水平达到峰值，随后开始减弱，直至第42 h 其表达又出现增强的现象。这说明环境致病菌-大肠杆菌也能够诱发小鼠乳腺炎的发生。综上所述，以上几大主要病原菌通过损伤的小鼠乳头或乳腺黏膜侵入乳腺组织并蔓延，导致小鼠乳腺感染，局部发生肿胀，最终表现出炎性症状。

1.2 LPS 诱导的小鼠乳腺炎模型 LPS 是革兰氏阴性菌如大肠杆菌外膜最主要的组成部分，为主要的致病毒力因子，进入动物机体后，能够引起强烈的炎症反应。王莹在小鼠腹腔中注射0.5 mL/100 g 体重的10%乌拉坦麻醉剂对其进行麻醉，随后对小鼠第4 对乳房进行消毒，充分暴露乳头，剪去乳头最尖端0.5 mm，用微量进样器于乳房基部灌注50 μL 浓度为0.2 mg/mL LPS溶液，结果显示，乳腺组织细胞变形、坏死，腺泡和小叶的正常结构消失，大量的乳腺上皮细胞脱落及存在炎性细胞浸润等现象。由此可见，LPS 能够诱导小鼠乳腺炎的发生。李德朋在BALB/c 母鼠第4 对乳腺分别灌注50 μL 浓度为0.2 mg/mL 的LPS 溶液，成功建立了小鼠乳腺炎性损伤模型。牟瑞营等使用LPS 乳导管灌注对小鼠进行攻毒，攻毒24 h 后，小鼠腺泡中含有大量嗜中性粒细胞，乳腺组织出现明显的充血和淤血现象，乳腺腺泡壁呈现出明显的水肿和增厚现象，表明LPS 能够诱发小鼠乳腺炎。赖金伦将50 μL 0.2 mg/mL LPS 溶液沿乳导管缓慢地灌注到小鼠乳腺内，结果显示LPS 能够引起小鼠乳腺组织的肿胀、充血和大面积出血斑甚至坏死灶的现象，并蓄积了大量凝乳块，腺泡壁也出现明显增厚的现象，腺泡腔内充斥大量的中性粒细胞和巨噬细胞等一系列的炎性症状。赵慧朵等对BALB/c 小鼠第4 对乳头消毒后，在其前端剪开一小口，将50 μL 2 mg/mL LPS 注射乳头内，攻毒24 h 后，小鼠的乳腺呈现乳泡壁增厚、乳泡结构被破坏及乳泡内伴有炎症细胞浸润现象，表明乳腺炎小鼠建模成功。综上，LPS 能够刺激小鼠乳腺组织，其脂质A 可与Toll 样受体4（TLR4）相互作用，进一步激活巨噬细胞，释放炎症因子，从而造成乳腺组织水肿、充血、损伤等炎症性反应。

1.3 肠道菌群移植模型 传统兽医学认为动物乳腺炎主要是由于病原菌感染乳头导致，而近几年研究表明肠道菌群失衡也可引发乳腺炎。马晨等首次将乳腺炎奶牛的粪便加入生理盐水，混合均匀后对无菌小鼠进行灌胃（0.3 μL/ 只），移植后可引起小鼠乳腺炎的病理症状，同时引发血清、脾脏和结肠中的炎症，而在移植健康奶牛的粪菌组并未出现以上病理症状，表明通过移植乳房炎奶牛粪便能够成功建立小鼠乳腺炎疾病模型。另外，通过宏基因组学分析小鼠肠道菌群，发现肠道菌群的功能基因在移植乳房炎奶牛粪便的小鼠组肠道菌群与移植健康奶牛粪便的小鼠组中的肠道菌群呈现出差异显著的现象。以糖酵解、酮体和丙酮酸代谢通路等为代表的能量代谢系统在移植健康奶牛粪便小鼠组中更为活跃，通路中的关键蛋白编码基因出现频次在移植健康奶牛粪便的小鼠组中的数量显著高于移植乳房炎奶牛粪便的小鼠组。推测其致病机制，一方面，这可能与肠道菌群的改变能够增加肠道通透性，导致慢性炎症发生有关；另一方面，可能与小鼠树突状细胞摄取肠道细菌，通过诱导与乳汁白细胞迁移相关的细胞回路，参与肠道特定菌向乳房运输有关，致使肠道菌群中特定细菌通过肠道-乳腺通路进入乳腺，从而诱发炎症，可进一步探究。综上，动物健康的肠道菌群有助于预防其乳房炎发生，可为未来防治乳腺炎提供新视角。

1.4 乳汁中分离致病菌建立模型 金黄色葡萄球菌是奶牛乳腺炎感染的主要致病菌之一，鉴于其在乳腺炎病原学中的重要地位，科研人员对乳腺炎的病牛乳汁样品病原菌进行分离、接种于小鼠乳腺组织，其目的是更接近临床奶牛自然发病的情况，有利于指导特定病原菌造成的具体病例的治疗。张静将从乳腺炎病牛乳汁样品中分离的金黄色葡萄球菌接种小鼠第4 对乳腺，结果显示小鼠感染后，乳腺充血、水肿及有炎性细胞浸润，腺上皮细胞坏死、脱落；TNF-含量发生急剧变化，攻菌6 h 后，TNF-含量增加3 倍，达到最高值。表明小鼠乳腺发生了急性炎症反应，导致机体产生大量的炎性细胞因子。谭炳海等、吕琛等从患病奶牛的乳汁中分离、筛选致病性金黄色葡萄球菌，并用此病原菌对小鼠进行攻毒，发现随着金黄色葡萄球菌浓度增加，乳腺组织的病理学变化逐渐加重，乳腺上皮细胞（肌上皮细胞和腺上皮细胞）发生溶解，并伴随着大量脂肪细胞浸润现象，表明小鼠乳腺炎造模成功。王娜娜等从患有乳腺炎的病牛乳样中分离金黄色葡萄球菌，并进行诱导感染BALB/c 小鼠第4 对乳腺，发现攻菌后24 h可观察到大量的中性粒细胞充血、浸润及腺上皮细胞坏死等病理变化现象；TNF-含量增加了2 倍；诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和3-硝基酪氨酸（3-NT）在乳腺组织中大量表达，提示参与了攻菌后乳腺炎的病理过程。综上，从乳腺炎病牛乳汁中分离的金黄色葡萄球菌感染小鼠后，严重损害乳腺组织，乳腺上皮细胞受到损伤，并含有大量的炎性细胞等，这为以奶牛作为直接实验对象的相关发病机制及其防控问题提供了有效解决途径。

2 中草药防治小鼠乳腺炎的机理研究

2.1 抑制或杀灭病原微生物 中草药对小鼠乳腺炎具有较理想的效果，其防控机理主要包括：①直接作用于病原菌，即直接抑制或杀灭病原微生物；已有报道表明，黄芩苷、大黄酚、胡黄连苷、姜黄素、盐酸小檗碱、没食子酸等中草药的关键活性物质能够直接抑制、杀灭乳腺炎源的病原菌如金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌等。②通过增强动物机体的免疫力的方式间接抑制或杀灭病原菌。中草药活性物质如多糖、甙类、有机酸、挥发性成分、生物碱等均具有免疫调节功能，它们能够刺激动物免疫系统，调节体内非特异性抗菌因子，促进细胞活性因子的生成，增加动物抗体的生成，增强非特异性免疫，提高巨噬细胞的吞噬能力等。

2.2 抑制乳腺炎症反应及调控乳腺细胞炎症信号通路 据报道，中草药抗炎治疗是治疗动物乳腺炎的有效方法。Xu 等调查了五味子提取物SchA 对LPS 诱导的小鼠乳腺炎的影响，发现32 mg/kg SchA 减轻了炎症反应，降低了LPS 诱导的乳腺组织损伤程度、髓过氧化物酶（MPO）活性和促炎因子TNF-、IL-6 表达水平；SchA 通过抑制雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路、单磷酸腺苷激活的蛋白激酶-Unc 样激酶1（AMPKULK1）信号通路，诱导细胞的自我吞噬能力及激活核因子E2 相关因子2（Nfr2）信号通路对患病小鼠发挥保护作用。由此可见，五味子提取物SchA 可以防治小鼠乳腺炎。Ge 等、王莹、于逸凡等检测了蒲公英提取物对金黄色葡萄球菌、LPS 诱导乳腺炎的防治效果，发现蒲公英提取物能够降低小鼠血清中炎性因子TNF-、IL-6 和白细胞介素1（IL-1）含量和MPO活性，抑制TLR2 表达，降低细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）、MAPK p38、NF-B p65 和NF-B 抑制蛋白（IB）的表达水平，缓解了乳腺组织病理损伤和坏死、炎性细胞浸润、水肿和脱落的程度。这表明蒲公英主要通过调控关键蛋白及磷酸化蛋白表达、活化NF-B 和MAPK 信号通路，调节TLR2 涉及的金黄色葡萄球菌/LPS 诱导的乳腺炎反应，最终达到防控乳腺炎的目的。赖金伦评价了靛玉红对LPS 诱导的小鼠乳腺炎的防治效果，发现靛玉红显著改善了小鼠乳腺组织的炎症状况，抑制MPO 的活性和促炎因子TNF-、IL-1和IL-6 表达，且具有剂量依赖性。此外，研究发现靛玉红能够抑制小鼠乳腺上皮细胞（MMECs）NF-B 通路中p-p65 和p-IB水平、MAPK 信号通路中的p38、ERK 和c-Jun 氨基末端激酶（JNK）的磷酸化及B 淋巴细胞瘤-2/xL（Bcl-2/Bcl-xL）抗凋亡基因蛋白、促凋亡Bcl-2 家族蛋白成员Bax/Bak、半胱天冬酶-3/8（Cspase-3/8）等促凋亡基因/蛋白水平的表达。由此可知，靛玉红对LPS 诱发的小鼠乳腺炎具有很好的治疗效果，在治疗乳腺炎方面具有潜在的临床应用价值。

Ran 等研究发现薯皂苷素能够减轻LPS 诱导的小鼠乳腺组织的坏死，促进抗炎因子IL-1表达及抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体的激活。此外，薯皂苷素能够激活AMPK/Nrf2 信号通路，抑制NLRP3/消皮素D（GSDMD）通路蛋白诱导的小鼠乳腺表皮（mMEC）细胞焦亡。表明薯皂苷素对小鼠乳腺炎具有良好的保护效果，但其抗细胞凋亡的功能与机制仍不清晰。Akhtar 等调查了常春藤苷C（HDC）对金黄色葡萄球菌诱导的小鼠乳腺炎的影响，发现HDC 减轻了小鼠乳腺组织的损伤程度，抑制了促炎因子IL-6、IL-1和TNF-的表达，提高了抗炎因子白细胞介素10（IL-10）的表达水平。此外，HDC 通过调控MAPKs（p38、ERK 和JNK）和NF-B（p65和IB）信号通路抑制了TLR2 和TLR4 的表达和炎症反应的发生。张进红等研究发现黄芩苷能够降低无乳链球菌对小鼠乳腺的感染程度，降低炎症因子-干扰素（IFN-）和IL-4 水平。这说明黄芩苷对小鼠乳腺炎具有较好的治疗效果；黄芩苷通过调节Th1/Th2 平衡来减轻小鼠乳腺的炎症反应。匡海学等研究结果显示商陆皂苷对LPS 诱导的小鼠乳腺组织的损伤具有很好的保护作用，可能与商陆皂苷抑制TLR4/NF-B 信号通路蛋白的表达有关。

张彩云等研究了连翘、金银花对金黄色葡萄球菌诱导的小鼠乳腺炎的防治效果，发现金银花能够降低小鼠乳腺中细菌感染的数量，效果优于连翘和金银花的复合药；预防组和治疗组均改善了小鼠乳腺组织的病理变化，降低了小鼠血清中TNF-含量。牟瑞营等研究发现10～30 μg/kg 木犀草素能够显著抑制LPS 诱导的炎性细胞因子TNF-、IL-1和IL-6 的表达及p65、IB的磷酸化，并呈剂量依赖性。Liu 等调查了鱼腥草素钠（SH）对LPS 诱导BALB/c 小鼠乳腺炎的防控作用，发现SH 能够减轻小鼠乳腺病理组织的损伤程度，降低MPO 活性，下调炎性因子IL-1、IL-1、IL-6和TNF-的表达，抑制LPS 诱导的p65 蛋白的磷酸化和IB的降解。由此可见，SH 通过抑制NF-B 信号通路对小鼠乳腺炎发挥抗炎作用。

此外，其他中草药提取物如穿心莲内酯、咖啡酸、百里香酚、蒲公英甾醇、千金藤碱、白藜芦醇等对LPS诱导小鼠乳腺炎均具有良好的治疗功效，能够显著改善乳腺组织损伤，通过抑制乳腺组织中炎性细胞因子如TNF-、IL-6 和IL-1表达和抑制NF-B 和MAPKs信号通路的激活而发挥对小鼠乳腺炎的治疗作用。

2.3 增强机体免疫力 中草药对动物免疫功能具有多方面的影响，可激活单核巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞，促进B 细胞和T 淋巴细胞的增殖与分化，促进免疫器官的发育和提高机体的免疫力，从而提高机体的防病抗病能力。站永波研究蒙药复方制剂对混合菌感染的小鼠乳腺炎的抗炎与免疫机理方面的影响，发现蒙药复方制剂能够抵抗致病菌的入侵，减轻小鼠腺泡结构的破坏，促进病理乳腺恢复，显著提高巨噬细胞的吞噬力和淋巴脏器指数；同时，蒙药提高了红细胞C受体花环率（CbRR），降低了红细胞免疫复合物花环率（ICR），提高了小鼠T 淋巴细胞分化簇 3（CD3）、T 淋巴细胞分化簇4（CD4）、B 淋巴细胞分化簇19（CD19）细胞百分率和CD4/分化簇8（CD8）的比值。由此可见，蒙药复方制剂通过提高免疫力对小鼠乳腺炎起到了一定的防治效果。一方面，蒙药增强了小鼠的免疫应答速度与强度；另一方面，蒙药有效控制了炎症反应，降低对小鼠乳腺组织的损伤，在免疫系统内部有效调控免疫应答，从而有效清除病原菌，达到抗菌消炎的目的。包金荣分析了由柯子、黄柏等7 味药组成的2 种蒙药复方的4 种萃取物对小鼠乳腺炎抗菌消炎的影响，结果显示，2 种蒙药复方的乙酸乙酯和正丁醇萃取液在体外对葡萄球菌具有更强的抑菌效果；水母液和石油醚萃取液在乳腺炎模型小鼠体内表现出更强的免疫功能，显著提高了小鼠B/T 细胞百分率和CD4/CD8比值、单核巨噬细胞的吞噬能力、脾脏NK 细胞活性、脾脏免疫应答与调节能力、红细胞免疫黏附力和红细胞膜CRI 活性，降低了TNF-、IL-6 等炎性因子的表达，其防效优于左旋咪唑。综上，蒙药复方制剂能够提高乳腺炎模型小鼠的特异性免疫和非特异性免疫功能，降低炎症性反应，可作为预防动物乳腺炎的一种前景药物。

2.4 调控肠道菌群平衡 动物肠道菌群是一个庞大的微生态系统，与许多疾病的发生密切相关。研究表明，动物患乳腺炎以后其肠道菌群在物种结构和功能特征上都会发生一定的变化。因此，后肠道中的菌群被视为诊断奶牛乳腺炎的潜在指标。刘凡铭等分析乳腺炎小鼠肠道菌群改变及与炎性因子的相关性，发现高剂量（10CFU/25 μL）攻菌组（金黄色葡萄球菌）的乳腺组织呈现出明显的炎性病理变化；TNF-表达量显著升高，小窝蛋白（Cav-1）表达量显著降低；厚壁菌门丰度增高，拟杆菌门、疣微菌门丰度降低，变形菌门无显著变化，这说明乳腺炎小鼠的肠道菌群与炎症具有一定的相关性。Hu 等研究肠道菌群在金黄色葡萄球菌诱导的小鼠乳腺炎疾病模型中的功能，发现当肠道菌群失调时，小鼠的血乳屏障通透性会增加，进一步加重乳腺炎症状；同时，致病菌肠杆菌的丰度得到提高，产生短链脂肪酸的菌种如厚壁菌与拟杆菌的数量明显降低，短链脂肪酸含量下降；粪便移植小鼠后或者口服丙酸钠、丁酸钠和益生菌能够缓解以上状况的发生。由此可知，肠道微生物群在对动物乳腺炎的防御中起着一定的保护作用。

Guo 等调查了穿心莲丁素（Deh）对乳腺炎小鼠的影响，发现Deh 显著降低了TNF-、IL6、IL-1、MPO、环氧合酶2（COX2）和iNOS 蛋白的表达水平，降低了炎症反应，但是Deh 对肠道菌群并未产生影响。截止目前，“中草药-乳腺炎-肠道菌群”三者之间的关联性、如何互作及作用机制等尚不明确，但以“肠道-乳腺轴”作为靶点是今后治疗乳腺炎的一种全新的治疗思路，值得进一步探索。

3 中草药防治小鼠乳腺炎存在的问题及展望

中草药防治小鼠乳腺炎已取得了一定的初步效果，但仍然存在一些问题亟待解决，主要包括：①中草药防治小鼠乳腺炎的物质基础尚不十分明确；②中草药防治小鼠乳腺炎的作用途径、靶位点及其机制不完全清晰；③中草药防治小鼠乳腺炎的制剂水平落伍，质量不稳定，缺乏国家标准。针对以上问题，在今后的开发应用中，一方面，有针对性地利用中草药的有效成分进行研究，开展定性与定量分析及标准化研究，做到科学、合理、有度；拓宽中草药来源，充分开发利用中草药资源；进一步阐明中草药有效成分及其构效、量效关系。另一方面，关注肠道菌群在宿主防御乳腺炎的过程中的功能研究，失调的肠道菌群可能是引发乳腺炎的原因之一。因此，恢复肠道菌群功能的中草药可能是今后潜在的治疗策略，可以围绕“肠道-乳腺轴”开发新型、高效、安全与稳定的中草药制剂，重塑肠道菌群平衡，为奶牛乳腺炎的防控提供全新视角，也是一种具有前景的新思路。

4 小结

中草药具有低毒、无残留、不易产生细菌耐药性等特点，在防治动物乳腺炎具有巨大的潜力。一方面，中草药可有效抑制病原微生物的增殖，从根本上去除病因；另一方面，中草药能够减轻炎症反应的发生，增强机体的免疫功能，达到标本兼治的效果，从而实现预期的治疗目标。因此，在今后的研究中充分利用现代医学技术手段，阐明中草药的药效、作用机制，开发出更多优质、高效、安全和稳定的防治动物乳腺炎的中草药制剂。