杉木根边缘细胞生物学特性及其对铝胁迫的响应*

李舟阳 陆文玲 钱 旺 黄奕孜 林二培 黄华宏 童再康

(浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室 杭州 311300)

根边缘细胞(root border cells, RBCs)是指在植物根生长过程中从根冠游离下来的一类具有生物学活性的细胞，存在于根际水溶性的黏液层中(Hawesetal., 2000, Driouichetal., 2007)。根边缘细胞来源于根冠分生组织细胞，具有特有基因表达和代谢模式，其发育过程受到严格的遗传调控(Driouichetal., 2007, Watsonetal., 2015)，能够分泌含有多糖、小分子蛋白、过氧化氢酶、类黄酮抗生素等活性物质的黏液，在根尖受到土壤中非生物和生物胁迫时起到重要的保护作用。果胶甲基酯酶(pectin methylesterase, PME)可以使果胶去甲基化和果胶酸分解，它的活性与边缘细胞从根冠分离有密切的关系，在根边缘细胞的产生和发育中有重要作用(Wenetal., 1999,Stephensonetal., 1994)。目前，已在3种植物中发现边缘细胞，并研究了其数量、活性等生物学特性，但多数研究集中在大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)和小麦(Triticunaestvum)等作物(Panetal., 2002, Hamamotoetal., 2006, Curlango-Riveraetal., 2013)，而对杉木等裸子植物则少有报道。

铝是地壳中含量最丰富的金属元素。在正常环境下，铝以Al(OH)4的形式存在，其形态会随pH值降低转变为Al(OH)3、Al(OH)2、Al(OH)2+。在pH<5的酸性土壤中，部分铝元素以Al3+方式存在，这种形态的铝离子对植物生长的毒害最强，会严重影响植物根的伸长和水分养分吸收，最终导致作物减产(Sadeetal.， 2016)。植物响应铝胁迫的机制非常复杂，且内在调控机制尚不明确(Brunneretal., 2013, Liuetal., 2014)。已有研究表明，根边缘细胞和根冠分泌的黏液会吸附铝离子，降低铝离子在根尖的积累，从而提高植物的耐铝性(Barceletal., 2002, 蔡妙珍等， 2012, Caietal., 2013)。

杉木(Cunninghamialanceolata)是优良速生针叶树种，也是我国南方最重要的用材树种之一，主要分布在南方富铁铝化酸性土壤中。近年来，随着全球酸沉降的加剧，我国土壤的酸化程度和面积都在不断加大，导致土壤中铝含量显著增加，从而进一步加剧了铝对杉木等森林植物的毒害(张玲玉等， 2019，俞飞等， 2014)。杉木人工纯林多代连栽也会导致土壤酸化，进而诱发铝毒害，是造成杉木连栽障碍、生产力下降的主要因素之一(罗承德等， 2000，雷波等， 2014)。本研究以杉木幼苗为材料，观测杉木根边缘细胞的数量、活性和形态等生物学特性，分析边缘细胞的产生和游离与果胶甲基酯酶(PME)活性的关系，研究杉木根边缘细胞对铝胁迫的响应，以期为阐明杉木根边缘细胞发育调控规律及其铝胁迫响应机制提供基础和依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料处理

选用由浙江省种苗管理总站提供杉木无性系‘龙15’和‘闽33’双系杂交种子园种子为试验材料。选取健壮饱满的种子，用水清洗干净后在无菌水中浸泡24 h，然后依次用75%酒精灭菌30 s后无菌水洗3次，5% 安替福明溶液灭菌10～15 min后无菌水洗3次，1%多菌灵浸泡10～15 min后无菌水洗3次； 最后将种子置于铺有湿润双层滤纸的培养皿中，于培养箱中24 ℃萌发10～15天。待种子萌发后，采用悬空气培法培养萌发的种子，具体过程如下： 用皮筋将湿润的纱网固定在黑色塑料营养钵上，将营养钵放入带有200 mL无菌水的烧杯中，然后将露白种子播于网孔中，烧杯用塑料薄膜封住，根在湿润空气中生长，每杯播20粒露白种子，置于24 ℃培养箱内培养。

1.2 试验方法

1.2.1 边缘细胞数量统计与活性检测 取相同根长的幼苗5株，将根浸入500 μL 无菌水中1～2 min，用移液枪头轻轻吹打，使边缘细胞充分释放到水中，用于细胞数量统计和活性检测。利用二乙酰荧光素(flurescein diacetate, FDA)-碘化丙啶(propidium iodide, PI )双染色剂染色检测细胞活性和统计细胞数量，主要步骤： 加FDA-PI染色液于细胞悬液至终浓度1 g·L-1(w/v)，混匀后避光染色10 min，然后轻轻反复吹打混匀，每次吸取50 μL细胞悬液于单孔载玻片上，置于荧光显微镜(Leica DM4000)下观察细胞形态及活性(活细胞呈绿色，死细胞呈红色)； 因边缘细胞形状不规则且易黏连，需对细胞悬液中的所有细胞观察统计，最后统计活细胞和死细胞个数，计算每个根的边缘细胞数和活性，细胞活性=活细胞数量/细胞总量×100%。试验重复3次。

1.2.2 根冠PME活性检测 在悬空气培过程中，分别剪取20 个初生根长度为<0.5、0.5、1.0、1.5、2.0 和2.5 cm的幼苗根尖，用于PME活性检测。将根尖置于组织匀浆器中，加入150 μL PME提取液(0.1 mol·L-1citric acid，0.2 mol·L-1Na2HPO4，1mol· L-1NaCl，pH 5.8)充分研磨； 将充分研磨的匀浆转移至1.5 mL离心管中，冰浴1 h，期间每隔20min震荡1次； 12 000 r·min-14 ℃条件下离心10min，取上清液，即为PME酶液。参考Pan等(2004)的方法进行PME酶活性检测。取20 μL上述PME酶液加到4 mL底物溶液[5 g·L-1(w/v)果胶，0.2 mol·L-1氯化钠，1.5 g·L-1(w/v)甲基红，pH6.8]中混合均匀，37 ℃水浴2 h，然后用分光光度计测525 nm的吸光度。分别取15、30、45、60、75、90、105和120 μL 0.01 mol·L-1HCl加入4 mL底物溶液中混合均匀，用分光光度计测525 nm的吸光度，重复3次。以吸光度为横坐标，H+的量为纵坐标，绘出吸光度与H+的量之间的标准曲线，并计算回归方程。利用标准曲线回归方程计算PME活性[μmol H+(root cap)-1h-1]，重复3次。

1.2.3 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)处理 EGCG是PME酶的抑制剂，可用于分析PME酶被抑制后的边缘细胞发育情况(Mravec,2017)。取根长1.5 cm的幼苗，用干燥的滤纸轻轻擦去根尖上的粘液与细胞(在体视镜下检查边缘细胞是否已完全擦除)，将根尖置于单孔载玻片上，分别加清水25 μmol·L-1浓度的EGCG，盖上盖玻片后培养48 h，在体视镜下定时观察根尖边缘细胞形成与游离情况。

1.2.4 铝胁迫处理及幼苗根长的测量 取根长约1.5 cm左右的种子苗，分别保留黏液层(边缘细胞)和擦除黏液层(边缘细胞)(按1.2.3的方法擦除黏液层)，测量每株种子苗的根长，置于0、50、100和200 μmol·L-1AlCl3溶液中，处理24 h后测量根的绝对生长量。在配制不同浓度的AlCl3溶液时，加入0.5 mmol·L-1CaCl2以避免单盐毒害，pH值调至4.5。每个处理10株种子苗，重复3次。

1.2.5 桑色素染色检测铝离子的分布与吸收 桑色素(Morin)能与铝离子形成络合物，可以检测铝离子在根尖的分布和吸收情况(Ohetal.， 2014)。取铝胁迫处理后的幼苗，用无菌水清洗2次去除残留的AlCl3溶液，加100 μmol·L-1的桑色素避光染色1 h，在荧光显微镜观察记录染色情况，并利用ImageJ软件对荧光值定量。

1.2.6 边缘细胞黏液层面积测定 取根长约1.5 cm的种子苗，按1.2.1的方法收集边缘细胞，分别置于0、100、200、300和500 μmol·L-1AlCl3溶液进行处理。利用墨水染色的方法测定黏液层面积 (Caietal.， 2013； Ropitauxetal.， 2020)，取50 μL细胞悬浮液加黑色墨水(用水稀释5倍)染色，在体视显微镜观察拍照并用ImageJ软件计算黏液层面积，每个处理至少测量15个边缘细胞，重复3次。

1.3 数据分析

所有数据均采用SPSS软件中的独立样本T检验进行方差和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 杉木根边缘细胞的生物学特性

边缘细胞的产生与游离与根生长发育过程密切相关。杉木种子萌发过程中，当胚根被种皮包裹时，边缘细胞并未产生(图1A)； 而当胚根从种皮露出时(露白)，就可观察到边缘细胞已经产生并游离在根尖周围(图1B)； 随着根的伸长，根边缘细胞数量逐渐变多，且游离到了根际的黏液层中 (图1C—H)。杉木根边缘细胞具有3种形态： 椭圆形、中间形、长条形，且这3种形态的细胞主要分布区域不同，其中椭圆形细胞一般游离在根冠的尖端部位，中间形细胞主要分布在分生区的位置，长条形细胞则大部分分布在根的伸长区部位(图2)。进一步统计表明，根际的边缘细胞数量随着根的伸长先逐渐增多后下降，根长1.0 cm时平均3 678 个左右； 根长1.5 cm时最多，平均达 7 497个； 随后呈下降趋势，根长2.5 cm时平均 5 731个，并保持基本稳定 (图3A)。边缘细胞活性在根长小于0.5 cm时可达95%，以后随着根的伸长会逐渐降低，但保持在80%以上，在根长2.0 cm时趋于稳定，基本在80%左右 (图3B)； 不同形态的边缘细胞活性不同，椭圆形细胞活性最高，可达95%； 中间形细胞活性次之，平均92%左右； 长条形细胞活性最低，平均仅78%左右(图3C)。

图1 不同根长杉木幼苗的边缘细胞Fig. 1 Development of root border cells during root growth of C. lanceolata seedlingsA.胚根； B.根长<0.5 mm； C.根长0.5 mm； D.根长1 mm； E.根长10 mm； F.根长15 mm； G.根长20 mm； H.根长25 mm. Bar=100 μm. A. Radicle; B.Root length <0.5 mm; C. Root length 0.5 mm; D. Root length 1 mm; E. Root length 10 mm; F. Root length 15 mm; G. Root length 20 mm; H. Root length 25 mm. Bar=100 μm.

图2 杉木根边缘细胞的形态(右)及其在根部的分布区域(左)Fig. 2 Root border cells’ morphotypes (right) and their distribution (left) in different root zones ofA:椭圆形； B:中间形； C:长条形。Bar=100 μm.A:Elliptical; B:Intermediate; C:Elongated. Bar=100 μm

图3 杉木根边缘细胞的数量和活性的变化Fig. 3 The number and viability of root border cells during root growth in C. lanceolataA：不同根长杉木幼苗边缘细胞数量； B：不同根长杉木幼苗边缘细胞活性； C：不同形态的杉木根边缘细胞活性。 A： The number of root border cells during root growth; B： The viability of root border cells during root growth; C： The viability of root border cells with different morphotypes.

2.2 PME酶活性对杉木根边缘细胞发育的影响

PME酶活性高低与根边缘细胞的发育及其从根冠的游离有直接联系(Wenetal., 1999, 张裕晨等， 2008)。本研究对不同根长杉木幼苗根冠的PME酶活性的测定结果表明，在刚露白(<0.5 cm)时，根冠PME相对活性最高，达到1.3 μmol·L-1H+(root cap)-1h-1； 根长为0.5～1.5 cm时PME酶活明显下降，但稳定在0.7 μmol·L-1H+(root cap)-1h-1左右； 而随根伸长至2.0 cm以上时，PME酶活则进一步降低至0.4 μmol·L-1H+(root cap)-1h-1。

图4 不同根长杉木幼苗根冠PME活性变化Fig. 4 Changes in PME activity of root caps during root growth in C. lanceolata

为进一步分析PME酶活性与边缘细胞发育的相关性，将杉木幼苗根尖的边缘细胞擦去后用PME酶的抑制剂EGCG进行处理，观察边缘细胞发育和游离情况。如图5所示，在对照组(0 μmol·L-1EGCG)中，擦除边缘细胞的根尖会逐渐再生出边缘细胞，至36～48 h时，可看到有大量边缘细胞游离至根际环境中； 而经25 μmol·L-1EGCG处理后，根尖也会再生出边缘细胞，但36～48 h后仅有少量边缘细胞游离至根际，大量边缘细胞呈片状且黏连在根冠处。以上结果表明，PME酶被抑制后并不影响边缘细胞产生，但明显抑制了边缘细胞从根冠游离至根际的过程。

图5 EGCG处理对杉木根边缘细胞发育和游离的影响Fig. 5 Effect of EGCG on root border cells release (Bar=100 μm)

为分析铝胁迫对杉木幼苗根生长的影响以及边缘细胞在铝胁迫中可能的作用，对保留和擦去边缘细胞的杉木幼苗根进行铝胁迫处理。由图6可知，在保留边缘细胞时，低浓度(50 μmol·L-1)的Al3+处理不会明显影响幼苗根生长； 随Al3+浓度提高到100 μmol·L-1，杉木幼苗根伸长受到显著抑制，24 h的平均根生长量为0.232 8 cm，而对照(0 μmol·L-1)为0.292 cm； 当Al3+浓度提高至200 μmol·L-1时，24 h的平均根伸长量仅为0.169 6 cm，与对照差异极显著(P<0.001)。以上结果表明，较高浓度的Al3+对杉木幼苗根有明显毒害。而擦除边缘细胞后，低浓度(50 μmol·L-1)的Al3+明显抑制根生长，且抑制作用随Al3+浓度提高更明显； 如当Al3+为200 μmol·L-1时，去除边缘细胞的根24 h平均生长量仅0.130 4 cm，与对照和保留边缘细胞的根生长量均差异极显著(P<0.001)(图6)。以上结果表明，擦除边缘细胞的杉木幼苗根对Al3+表现出了更强敏感性，而边缘细胞的存在可缓解Al3+对根的毒害，起到保护根尖作用。

图6 Al3+ 对杉木幼苗根生长的影响Fig. 6 Effect of Al3+ on root growth of C. lanceolata seedlings*表示与对照(0 μmol·L-1)相比差异显著(P<0.05).**表示与对照(0 μmol·L-1)相比差异极显著(P<0.01).* indicates a significant difference at P<0.05 level.** indicates a significant difference at P<0.01 level.

2.3 铝胁迫对杉木幼苗根生长的影响

利用桑色素(morin)染色对铝胁迫处理后的Al3+在根尖分布结果的检测表明，在保留边缘细胞情况下，在根尖检测到较弱的荧光信号，且可观察到荧光信号出现在根际边缘细胞处(图7A-C)； 而在擦除边缘细胞后，无论低浓度和高浓度的Al3+处理后，均在杉木幼苗根尖检测到明显的荧光信号(图7D-F)。进一步利用ImageJ软件对根尖的荧光信号进行定量，结果如图7G所示，25 μmol·L-1Al3+处理，擦除边缘细胞的根尖荧光信号强度为81.15×105，比对照(保留边缘细胞)高58.43%； 100 μmol·L-1Al3+处理，擦除边缘细胞的根尖荧光信号强度为121.79×105，比对照高137.78%，呈极显著差异。以上结果表明，边缘细胞的存在能抑制根尖对Al3+的直接吸收，从而起到保护根尖减缓铝毒害的作用。

图7 桑色素染色检测Al3+在杉木幼苗根尖的分布Fig. 7 Detection of Al3+ distribution in root tips of C. lanceolata seedlings by morin stainingA～C： 保留边缘细胞的杉木幼苗根尖，分别受0、25和100 μmol·L-1 Al3+处理后的桑色素染色情况； D～F： 擦除边缘细胞的杉木幼苗根尖，分别受0、25和100 μmol·L-1 Al3+处理后的桑色素染色情况； Bar=100 μm； G： 不同Al3+浓度处理后的根尖荧光强度定量。 A-C： Morin staining of the root tips with border cells from treatment by 0, 25 and 100 μmol·L-1 Al3+, respectively; D-F： Morin staining of the root tips without border cells from treatment by 0, 25 and 100 μmol·L-1Al3+, respectively; Bar=100 μm； G： Quantitation of fluorescence intensity of the root tips from different treatments. *表示与对照相比差异显著(P<0.05).**表示与对照相比差异极显著(P<0.01).* indicates a significant difference at P<0.05 level.** indicates a significant difference at P<0.01 level.

2.4 Al3+对边缘细胞黏液分泌的影响

利用墨水染色对Al3+处理后的边缘细胞黏液层的检测结果见图8。较低浓度的Al3+会诱导边缘细胞分泌更多黏液。测量发现，当Al3+浓度100和200 μmol·L-1时，边缘细胞黏液平均面积为7 014和8 960 μm2，显著大于对照的5 015 μm2； 而当Al3+浓度达到300和500 μmol·L-1时，黏液平均面积为4 888和4 685 μm2，与对照无显著差异。以上结果表明，低浓度的Al3+会诱导边缘细胞分泌更多黏液，这可能是边缘细胞保护根尖免受Al3+毒害的主要原因之一。

图8 不同浓度Al3+对根边缘细胞黏液分泌的影响Fig. 8 Effect of Al3+ on mucilage exudation of root border cellsA-E：Al3+浓度0、100、200、300和500 μmol·L-1处理后边缘细胞黏液层； F：不同Al3+浓度处理后黏液层的面积； *表示与0 μmol·L-1相比差异显著(P<0.05).A-E，the mucilage layer of root border cells from treatment by 0, 100, 200, 300 and 500 μmol·L-1 Al3+, respectively. Bar = 50 μm. F： the area of mucilage layer of root border cells under different Al3+ concentrations； * indicates a significant difference at P<0.05 level.

3 讨论

植物根边缘细胞广泛存在于植物根际，有生物学活性，通过分泌多糖、小分子多肽甚至DNA等物质，在植物根系生长及抗逆中起着重要作用(Baetzetal., 2014, Hawesetal., 2016)。根边缘细胞的发育产生与根生长有密切关系，不同植物根边缘细胞的数量和活性存在一定差异。豌豆(Pisumsativum)边缘细胞在根长5 mm时开始出现，根长大于25 mm时达到最大值约4 000(Hawesetal., 1990; Zhaoetal.， 2000)； 而大麦(Hordeumvulgare)、大豆和花生(Arachishypogaea)等植物的根边缘细胞几乎与根同时出现，大麦边缘细胞在根长20～25 mm时达到最大值约1 400，活性最高可达95%； 大豆边缘细胞在根长10～15 mm时达到最大值约5 300，在根长15 mm时活性可高达94%； 花生边缘细胞在根长15 mm左右时数量最大，约10 000个左右，其活性可维持在90%(Panetal., 2004, 张裕晨等， 2008, 马伯军等， 2003, 马伯军等， 2005)。本研究中，杉木根边缘细胞也是几乎与根同时出现，数量随根的伸长逐渐增加，当根长为15 mm时达到最大值约7 500； 根边缘细胞的活性随根的伸长逐渐降低，但可维持在80%以上。这些研究结果表明，不同植物根边缘细胞的数量和活性存在差异，但其发育规律相似。

在植物根边缘细胞的发育和游离至根际环境的过程中，涉及到细胞壁结构的复杂动态变化，PME酶是该过程的重要调控因子(Kumaretal., 2020, Mravec, 2017)。PME酶是一种果胶修饰酶，其活性高低会直接决定细胞壁的刚性，与花粉管萌发、果实成熟、雄性不育和种子萌发等重要生物学过程密切相关(Xueetal., 2020, Zhangetal., 2018, Tangetal., 2020)。在根边缘细胞的发育和游离至根际的过程中，PME酶也是一个重要调控因子(Stephensonetal., 1994)。在多数植物中，PME酶的活性一般在根长较短(即边缘细胞开始产生)时较高，随着根的伸长(即边缘细胞增多)会逐渐降低(梁剑等， 2011, Panetal., 2004, 张裕晨等， 2008, 马伯军等， 2005, 周楠等， 2006)。如麻疯树(Jatrophacurcas)的PME酶活性在根长5 mm时最高，随根的伸长逐渐降低(梁剑等， 2011)。用PME酶的抑制剂EGCG对豌豆根尖进行处理，发现根冠PME酶的活性被抑制后并不会影响边缘细胞的产生，但会使边缘细胞相互黏连而无法游离至根际环境中，且游离下来的边缘细胞长度变小和弯曲角度变小(Mravecetal., 2017)。而本研究显示，杉木根冠PME的活性在根长小于0.5 cm时最高，随根的伸长降低，与边缘细胞的产生呈一定相关性； 而利用EGCG处理杉木根尖后，也出现了边缘细胞黏连在根冠处而不能游离到根际环境的现象。这些研究结果表明，PME酶可能与边缘细胞产生没有关系，但与边缘细胞游离到根际环境中有紧密关系。

在南方酸性土壤中，Al3+是限制植物生长和矿质营养吸收的主要胁迫因子之一(Magalhaesetal., 2018)。作为植物根际的屏障，根边缘细胞及其分泌的黏液层被认为在植物拮抗铝胁迫中发挥重要作用。如发现200 μmol·L-1Al3+处理可明显抑制黄瓜(Cucumissativa)根伸长，且高浓度(100～200 μmol·L-1)的Al3+会使边缘细胞的黏液层明显增厚(乔永旭， 2016)。对大豆研究发现，400 μmol·L-1Al3+也会明显抑制根伸长，且随Al3+浓度增加和处理时间延长，边缘细胞分泌的黏液显著增加； 如将黏液层(包括边缘细胞)去除后，Al3+对大豆根生长的抑制作用会更明显(Caietal., 2013)。本研究中，杉木幼苗根的伸长也受到Al3+抑制，且这种抑制作用在去除边缘细胞后更明显； 同时Al3+也会诱导杉木根边缘细胞分泌更多黏液。类似的，在菜豆(Phaseolusvulgaris)中也存在Al3+抑制根伸长和诱导边缘细胞分泌更多黏液的现象(Miyasakaetal., 2001)。而且在大豆中，相比铝敏感品种，耐铝的品种能通过根边缘细胞分泌的黏液固定更多Al3+，从而减缓Al3+对根尖毒害(Caietal., 2013)。本研究结果也显示杉木擦除根边缘细胞及黏液层后会有更多Al3+积累在根尖，Al3+对根的毒害也更明显。根边缘细胞及其黏液层具有固定Al3+的功能，边缘细胞会对Al3+作出响应，分泌更多黏液，从而起到减轻铝毒害或保护植物根尖免受铝毒害的作用。

4 结论

杉木幼苗在根生长过程中，会在根尖处产生大量边缘细胞，其数量最多可达7 497个，活性最高可达95%； 且这些边缘细胞游离至根际环境的过程可能主要受到PME酶调控。在一定浓度的铝离子胁迫下，杉木根边缘细胞会分泌更多黏液，形成更厚黏液层，从而起到减轻铝毒害或保护根尖免受铝毒害的作用。