干旱胁迫及外生菌根菌对马尾松幼苗根系形态及分泌物的影响*

李 敏 赵熙州 王好运 卢中科 丁贵杰

(贵州省森林资源与环境研究中心/贵州省高原山地林木培育重点实验室贵州大学林学院 贵阳 550025)

随着全球变暖逐渐加剧，陆地干旱面积、干旱时间和强度都在进一步增加(Dai， 2011)，植物生存和生长环境愈加严峻，增强植物适应干旱的能力对于维持自然生态系统生产力至关重要。在自然条件下，大约80%的陆地植物与菌根菌共生形成菌根(Plassardetal.， 2011)，其不仅能够促进土壤水分和养分获取以及向地上部分运输，而且有助于植物应对土壤水分亏缺的不利影响，对宿主植物的生存和生长至关重要(Lehtoetal.， 2011； Mraketal.， 2019)。外生菌根菌(ectomycorrhizal fungi, ECMF)多与木本植物形成共生(Marmeisseetal.， 2004)，在干旱胁迫条件下，外生菌根(ectomycorrhiza，ECM)能通过外延菌丝扩大植物对水分和养分的吸收面积，提高根系保水力(吴小芹等， 2009； 翟帅帅等， 2015； Zouetal.， 2015)，增加宿主植物根系生物量、总长度、平均直径、根尖数等根系性状(祁金玉等， 2018； 王如岩等， 2012； Plassardetal.， 2011)，是促生抗旱的重要因素。根系分泌物是植物与微生物交流且影响根际过程的重要途径，也是根系的一种功能性状(Sunetal.， 2020)，对植物养分吸收、改善土壤结构、稳定土壤有机碳(Mommeretal.， 2016； Sokoletal.， 2019； Heydarietal.， 2021)具有重要作用，在严重的非生物胁迫下影响植物的耐受性和存活。接种ECMF也能通过影响植物根系分泌活动改善植物的抗逆性，如分泌抗生素或萜类物质抑制病原菌(Marx， 1973)、小分子量有机酸和高分子胞外酶(如酸性磷酸酶、植酸酶)活化土壤养分，促进胁迫条件下植物养分吸收(Ho，1989； Wangetal.， 2020)。然而，在以往植物抗旱性研究中，相较于地上部分，作为对水分和养分感知的重要器官，也是感受干旱胁迫的原初部位，根系的反应常被忽视(Williamsetal.， 2020)；此外，植物根系性状对接种ECMF的反应是高度可变的，并依赖于真菌的种类甚至基因型，还受宿主和环境因素共同调控。因此，不同ECMF对植物根系性状的影响以及ECMF是否调控干旱胁迫影响植物根系性状需要进一步研究。

马尾松 (Pinusmassoniana)是中国特有的重要造林和用材树种，分布地区广泛，但面临季节性干旱且土壤养分贫瘠，严重限制其造林成活率和森林生产力。作为典型的菌根依赖性树种，ECMF在马尾松生长和抗旱过程中的有效性和重要性已被许多研究证实，但目前研究多集中在地上部分生理生化方面(马琼等， 2005； 王艺等， 2021)，对地下根系形态研究较少(翟帅帅等， 2015)，对其根系分泌物影响的研究更是鲜有报道。鉴于此，本研究以采自试验区马尾松林下的橙黄硬皮马勃(Sclerodermacitrinum， Sc)和琥珀乳牛肝菌(Suillusplacidus， Sp)为菌种，对1年生接菌和未接菌苗进行正常浇水和干旱胁迫处理，探究不同ECMF对马尾松幼苗根系性状(根系形态和分泌物)和根际环境的影响差异以及接种不同ECMF是否调控干旱胁迫对马尾松幼苗根系性状和根际环境的影响，以期为进一步揭示不同ECMF增强植物抗旱性机制及其在植物抗旱过程中的应用提供参考，为外生菌根抗逆性研究挖掘新菌种。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于贵州大学林学院温室大棚(26°26′—26°27′N，106°39′—106°40′E)，通风良好，搭遮荫网，试验期间温室大棚内均温24.7 ℃，平均湿度77.9%。

1.2 试验材料

琥珀乳牛肝菌(Sp)和橙黄硬皮马勃(Sc)子实体采自贵州省贵阳市花溪区青岩林场，在GenBank中序列登录号分别为MT994624和MT994623。参考Pachlewski等 (1974)方法，进行平板培养和液体菌剂的制备。每500 mL三角瓶中装入300 mL液体培养基，121 ℃灭菌30 min后，在超净工作台中利用6 mm打孔器取菌块，每瓶4菌块，置于25 ℃培养箱中进行暗培养，4周后取用。

马尾松种子采自贵州省都匀马尾松种子园内同一母树，2018年3月底，种子经KMnO4(0.5%)消毒，用无菌水清洗6次，后撒入装有经无菌水湿润的已灭菌蛭石中，于光照培养箱(25 ℃，光照和黑暗时间分别为14和10 h) 中培养28天，将芽苗移栽到装有经121 ℃灭菌2 h的混合培养基松表土/蛭石/珍珠岩(4∶1∶1，v/v/v，每盆4 kg)的塑料盆中(20 cm × 16 cm × 20 cm)，基质理化性质： pH含量4.65、有机质含量44.49 g·kg-1、全氮含量5.63 g·kg-1、碱解氮含量157.50 mg·kg-1、全钾含量8.84 g·kg-1、速效钾含量35.85 mg·kg-1、全磷含量0.15 g·kg-1和有效磷含量56.34 mg·kg-1。幼苗移栽的同时接种经过匀浆的液体菌剂(每株50 mL)，每盆3株。未接种(CK)幼苗用等量的空白培养基处理，每2天浇1次水。2种接菌苗菌根共生体形态见图1。

图1 菌根形态Fig.1 Mycorrhizal morphologySp： 琥珀乳牛肝菌Suillus placidus；Sc：橙黄硬皮马勃Scleroderma citrinum.

1.3 试验设计

试验设置浇水W(土壤含水量55%±5%)和干旱D土壤含水量(20%±5%) 2种水分条件，分别接种Sp和Sc以及未接菌处理(CK)。两因素组合共6个处理，每处理设置8盆，每盆3株幼苗，每处理24株幼苗，于2019年6月底选取长势一致的幼苗进行水分处理，每日采用称重法维持土壤含水量，处理60天后取样。

1.4 试验方法

每处理随机取8株(每盆1株)于水分处理第1天和第60天进行苗高和地径测量，用于计算处理期间苗高和地径净增长量。处理结束后，随机选其中3株用于测定根系形态(WinRhizo根系分析系统)，结束后，将各株苗分根、茎和叶烘干至恒质量，测定生物量，并以此计算根冠比。

根系分泌物收集鉴定： 6个处理的所有幼苗分别整株取出，用无菌刷刷取黏附于根系表面0～4 mm的土壤作为根际土，各处理收集的根际土充分混匀后4 ℃保存待用。根系分泌物获取采用乙醇浸提法(罗晓蔓等，2018)，并用GC/MS联用仪(HP6890/5975C，美国安捷伦)进行分析。色谱条件： 色谱柱为HP-FFAP (30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱，初始温度40 ℃ (保留2 min)，以4 ℃·min-1升温至220 ℃，保持15min，运行时间 62 min； 汽化室温度250 ℃； 载气为高纯He(99.999%)； 柱前压为47.6 kPa，载气流量为1.0 mL·min-1，不分流，5 min溶剂延迟时间。质谱条件： 离子源为EI源； 离子源温度230 ℃； 四极杆温度150 ℃； 电子能量70 eV； 发射电流34.6μA； 倍增器电压1 624 V； 接口温度280 ℃； 质量范围29～500 u。采用质谱计算机数据系统对总离子流图中的各峰进行检索，Nist17和Wiley275标准谱库进行物质鉴定，采用峰面积归一化法测定各成分相对含量。

侵染率测定： 随机取6株苗根系，小心冲洗根系，参考张中峰等(2016)方法准备待观察的根系，置于人体式显微镜徕卡(M205FA)下观察菌根形态，并用计数法计算侵染率(菌根侵染率=菌根侵染根尖数/所有检查根尖数×100%)。

采用试剂盒(苏州科铭，中国)测定根际土壤脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性，氯化三苯基四氮唑(TTC)还原法进行根系活力测定(李合生， 2000)，每个指标3次重复。

1.5 数据分析

用IBM SPSS 21 软件(IBM，USA)进行双因素方差分析(干旱、接菌以及干旱×接菌相互作用对相关指标的影响)和单因素方差分析，t检验和Ducan法进行差异显著性分析，采用OriginPro8.5(Origin Lab 公司，USA)软件作图。

2 结果与分析

2.1 接菌和不接菌幼苗生长对比分析

由表1可知，处理60天后，马尾松幼苗接菌(ECM)和干旱胁迫(Drought)对除根冠比外的其余指标均有显著影响，且二者交互作用对苗高和地径净增长量以及侵染率的影响达显著水平。相对浇水处理，干旱胁迫显著抑制马尾松幼苗生物量积累和生长，但对根冠比具有促进作用。

表1 不同接菌处理马尾松幼苗在不同水分条件下生长变化①Tab.1 Growth changes of Pinus massoniana seedlings treated with different inoculations under different water conditions

相对未接菌处理(CK)，浇水条件下，Sc和Sp对幼苗除根冠比外的其他生长指标促进作用均达显著水平(P< 0.05)。干旱胁迫下，2种接菌苗的苗高和地径净增长量、生物量和根冠比等均有升高，其中，除根冠比外，Sc处理下的幼苗生长指标均有显著增加(P<0.05)。

2.2 接菌和不接菌幼苗根系生长特征分析

由表2可知，接菌、干旱及二者交互作用均对幼苗根系生长具有显著影响。正常浇水条件下，相对CK，2种菌根菌处理显著提高了幼苗根长度、根尖数、平均直径等指标(P< 0.05)，Sc处理下的根系生长优于Sp处理。干旱胁迫显著抑制了接菌和未接菌幼苗根系生长(CK中平均直径除外)，但Sp中根体积、根尖数和分支数高于CK，增幅分别为11.1%、167%和55.8%； 相对CK，Sc处理对除根尖数外的其于指标的促进作用均达显著水平，平均直径和根体积增幅分别达137.8%和108.6%。

干旱胁迫降低了接菌和未接菌幼苗根系活力，但在2种水分条件下接菌苗均高于未接菌苗(图2)。

表2 不同处理下根系生长差异Tab.2 Root growth differences under different treatments

图2 根系活力变化Fig.2 The changes of root activity

2.3 接菌和不接菌幼苗根系分泌物差异

由表3和4可知，2种水分条件下，不同接菌处理中植物根系分泌物的组成和相对含量具有一定差异，Sp处理的化合物种类最少。本试验鉴定到的所有化学成分可归为6大类有机物质，包含28种化合物，各处理共有的化合物有19种。接菌和未接菌处理的各大类物质种类数表现基本相似，以酸类最多，其次是醛类和萜类，酮类和醇类仅1种； 醇类仅在CK和Sc中出现，且只有苯甲醇。同时，Sp处理中无柠檬烯、丙烯酸-2-乙基己酯、2-甲基丙酸和(E)-2-辛烯酸。Sc处理中无正癸酸和辛酸，CK中无(E)-2-辛烯酸和正癸酸。

表3 根系分泌物组成情况①Tab.3 Composition of root exudates

表4 不同处理中根系分泌物化学组分相对含量Tab.4 Relative contents of root exudate in different treatments

在所有处理中，酸类有机物质相对含量和种类均最多，而其中的棕榈酸在所有化合物中相对含量最高，2种水分条件下均CK>Sc>Sp； 同时，相对浇水，干旱胁迫明显降低了棕榈酸的含量，CK、Sc和Sp处理下分别降低了9.07%、5.94%和10.19%。硬脂酸相对含量仅次于棕榈酸，且在胁迫条件下降低。油酸也有较高相对含量，表现为Sp>Sc>CK，干旱胁迫降低其在Sp处理的相对含量，但增加了Sc处理和CK中相对含量。此外，干旱胁迫增加接菌和未接菌苗中的十四烷酸相对含量，且在浇水和干旱胁迫下均表现为Sp>Sc>CK。

其他类有机物质中，长叶烯在各处理中均具有较高相对含量，干旱胁迫下，其相对含量在CK中增加，在2种接菌苗中则下降。干旱胁迫对醛类中安息香醛作用与长叶烯相反，对CK具有抑制作用，但增加了接菌苗中的相对含量。

以上结果表明，接菌和未接菌马尾松幼苗根系分泌物在组成上具有一定的共性，但也存在差异，同时，各种化合物相对含量在不同处理间差异明显。

2.4 接菌和不接菌幼苗根际土壤酶活差异

由图3可知，接菌和干旱对3种土壤酶均有显著影响，二者协同作用仅对脲酶无显著影响。浇水条件下，接种Sp提高3种土壤酶活性，酸性磷酸酶、脲酶和蔗糖酶分别比CK增加了5.76%、61.04%和12.81%，Sc处理则显著提高脲酶和酸性磷酸酶活性(P<0.05)，增幅分别为57.67%和12.80%。干旱胁迫增加CK处理下3种酶活性，Sc处理下仅脲酶活性不显著增加，Sp处理中脲酶和蔗糖酶增加。干旱条件下，脲酶活性以接菌处理高于CK，表现为Sp(313.50)>Sc(278.84)> CK (236.00)，蔗糖酶以Sp(6.65)> CK (5.84)>Sc(3.47)，酸性磷酸酶以Sc(27.41)> CK (26.42)>Sp(24.48)。

图3 干旱胁迫和接菌处理对根际土壤酶活性的影响Fig.3 Effects of drought stress and inoculation treatments on rhizosphere soil enzyme activities

3 讨论

3.1 干旱胁迫下外生菌根菌对马尾松幼苗根系生长及活力的影响

外生菌根菌(ECMF)能有效缓解水分亏缺造成的负面影响(Sebastianaetal.， 2018； Lehtoetal.， 2011)。本研究中，接种Sp和Sc均能有效降低干旱胁迫对马尾松幼苗生长和生物量的抑制作用，且以Sc指标效果更佳。这可能是由于菌根形成改变了植物根系形态，同时，外生菌根能通过外延菌丝和菌索扩大植物根系吸收面积，增加水分传导效率(吴小芹等， 2009； Zouetal.， 2015)，有利于促进植物生长。此外，根系活力作为根系生命力的重要指标，影响地上部分的生长发育，2种水分条件下，2种接菌苗较高的根系活力促进了幼苗根系吸收能力。根系生长和吸收能力的提高，能增强宿主植物对水分和养分的吸收和运输能力，同时，也增强周围土壤的固碳能力，从而促进植物生长和胁迫条件下碳水化合物在根系的积累，缓解胁迫影响(Kingetal.， 1997)。因此，2种接菌苗比未接菌苗对干旱胁迫具有更强的适应性，在胁迫条件下生长表现更好，这与Sebastiana等(2018) 研究结果一致。但由于菌种不同，其对同一宿主植物的影响也不同(张中峰等， 2015； 吴强盛等， 2014)，干旱胁迫下，Sc对根系形态指标均具有促进作用，而Sp处理根系长度、表面积和平均直径反而比CK小，其原因可能是由于Sp处理吸收利用了更多分配到根系的碳水化合物，进而导致宿主植物根系形态受限(刘婷岩等， 2021)。

3.2 干旱胁迫下外生菌根菌对马尾松幼苗根系分泌物的影响

根系分泌物是植物自身的一种适应策略，常受各类生物和非生物因素的调控和制约(Kuzyakovetal.， 2001)。在相同环境条件下，植物根系分泌物组分差异除受自身遗传特性调控外，还主要受个体生理状态差异的影响(D’Orazioetal.， 2013； Zhuetal.， 2009)。本研究中，同一水分条件下，接种Sc增加了马尾松幼苗根系分泌物种类，而接种Sp则降低其种类； 同时，二者对各类分泌物相对含量作用也有异同，说明接种不同菌根菌会改变马尾松生理代谢活性，进而调控其分泌物组分的变化，根系活力的差异能证明这一点。此外，未接菌苗中根系分泌物直接外排到土壤，而接菌苗形成共生关系后，部分分泌物可能会被ECMF吸收利用，从而导致分泌土壤中的种类和数量发生变化(郭修武等， 2009)，这可能也是导致不同接菌处理苗根系分泌物组分差异的原因之一。Grayston等(1997)和Meier等(2013)研究也认为，根系分泌物组成和含量受共生菌根真菌类型调控，不同ECMF对分泌物影响不同。生长环境变化会导致植物自身代谢的变化，进而影响根系分泌物的释放特征(吴林坤等， 2014； Sasseetal.， 2018)，而接菌和未接菌马尾松幼苗则通过分泌更多种类的化合物响应干旱胁迫，这一结果也说明，根系分泌物种类的增加可能是马尾松响应干旱胁迫的保守行为。除种类增加外，各类分泌物相对含量也发生明显变化，如干旱抑制CK苗中酸类和醛类、增加萜类物质相对含量，而接菌苗中醛类和萜类变化与CK刚好相反，且酸类相对含量下降程度更大，说明各类分泌物相对含量在干旱胁迫下的变化受接菌处理影响。而干旱胁迫引起接菌苗中酸类物质相对含量下降程度更大，主要是由于包括棕榈酸、硬脂酸和苯乙酸在内的化感物质的相对含量下降更多或上升较少所致，而这些物质是很多植物中都已被广泛报道的自毒物质(张文明等， 2015； Huangetal.， 2010)，说明接种菌根菌可能通过降低各种抑制植物生长的化感物质相对含量来缓解干旱胁迫。干旱胁迫下，2种外生菌根菌对同一化合物相对含量变化影响也有异同。总体而言，干旱和接菌处理均导致马尾松幼苗根系分泌物组分及相对含量发生明显变化，同时，接菌能调控干旱胁迫下各类分泌物及其化合物相对含量的变化，且不同菌根菌作用有差异。目前，有关水分变化和接种菌根菌对植物根系分泌物组分和含量的影响及调控机制尚不十分清楚，同时，由于研究方法可能存在一定局限性，导致本次所检测到的分泌物种类还不是全部，因此，有关接种菌根菌对干旱胁迫下分泌物变化的内在调控机制有待深入的研究。各类分泌物对干旱和不同接菌处理的响应不同，这些变化是否参与调控马尾松幼苗的抗旱性以及这些响应是否是马尾松苗特有,还是在其他树种中也会产生，有待进一步研究。

3.3 干旱胁迫下外生菌根菌对马尾松幼苗根际土壤酶活性的影响

根系分泌物作为土壤酶的主要来源之一，其组分和种类变化会导致土壤酶活性变化(樊利华等， 2019)。土壤酶参与土壤养分循环过程，对植物根系生长具有重要影响，且能及时有效地对环境变化作出响应(许淼平等， 2018)。本研究中，干旱胁迫对CK中3种土壤酶，Sc处理的脲酶以及Sp处理的脲酶和蔗糖酶活性具有促进作用，但抑制了2种菌根苗土壤中的酸性磷酸酶活性。在2种水分条件下，Sc处理下的脲酶和磷酸酶以及Sp处理下的脲酶和蔗糖酶活性均高于CK。这些结果表明，ECMF的应用改变了根际土壤酶活性对干旱胁迫的响应，2种ECMF能通过增加不同土壤酶活性来促进根际土壤养分的转化和吸收，进而维持各种条件下宿主植物的生长。这与王艺等(2013)研究结果相似。本研究中Sc和Sp处理分别抑制了蔗糖酶和磷酸酶活性，这与以往ECMF对土壤酶活的促进效应有所不同(尹大川等， 2017； 罗晓蔓等， 2016)，具体原因还有待进一步研究，但推测这可能与接菌苗生长和生理代谢以及根系分泌物组成和数量等因素有关。

4 结论

1) 接种橙黄硬皮马勃(Sc)和琥珀乳牛肝菌(Sp)总体上能有效促进马尾松幼苗地上部分生长和地下根系的生长及活力，提高宿主植物的水分和养分吸收利用能力以及抗旱性，但对干旱胁迫的耐性和适应策略有所不同，Sc促进生长、抗旱效果更好。

2) 水分变化和接菌处理对根系分泌物组成和相对含量影响明显。其中，干旱和接种Sc能增加根系分泌物种类，接种Sp则降低。干旱导致各类分泌物相对含量发生明显变化，变化幅度和方向与分泌物种类有关； 同时，各类分泌物相对含量在干旱胁迫下的变化受菌根菌的调控，且2种菌根菌作用有差异。

3) 接种Sp能够通过提高根际土壤脲酶和蔗糖酶活性来抵御和适应干旱环境，而Sc则通过维持较高的酸性磷酸酶活性和脲酶活性来抵御和适应干旱环境。