血清DKK-1水平与类风湿关节炎伴肺间质病变的关系

杨 慧 陶 蓓 何成松

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以多关节炎为主要特征的自身免疫性疾病[1]。 RA发生肺间质病变(interstitial lung disease, ILD)提示病情较重,与无ILD 的RA 患者比较,预后较差,死亡的风险更高[2,3]。 DKK-1(Dickkopf-1)是一种可以抑制Wnt 信号转导通路的分泌蛋白。 研究发现,其参与了慢性炎症关节病的发病机制,并且与RA 患者疾病活动度具有一定的关系[4,5]。 Bongartz 等[6]研究指出,DKK-1 在特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)患者肺部的表达,与健康肺部比较,DKK-1 在纤维化中的mRNA 和蛋白质表达显著增加。 目前关于RA 合并ILD 患者血清中DKK-1 水平变化的研究较为少见。 本研究通过测定RA 合并ILD 患者血清中DKK-1 表达水平,探讨血清中DKK-1水平与RA 合并ILD 的关系。

对象与方法

1.研究对象：选取2020年10月1日～2021年8月30日就诊于西南医科大学附属医院风湿免疫科的112 例RA 患者。 纳入标准：符合2010年美国风湿病学会(American College of Rheumatism,ACR)/欧洲抗风湿病联盟(European League against Rheumatism,EULAR)修订的RA 分类标准[7]。 RA 合并ILD 的诊断标准参照美国胸科协会/欧洲呼吸协会(ATS/ERS)2002年制定的肺间质纤维化的分类标准[8]。排除标准：①合并严重肺部感染、肺结核、慢性阻塞性肺疾病、肺尘埃沉着病以及肺肿瘤等;②合并其他自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮、皮肌炎、干燥综合征等)、血液系统疾病(如白血病、多发性骨髓瘤)以及梅毒、HIV 等传染病史;③严重心脏、肺和肾脏功能不全的患者。 根据肺HRCT 结果,将患者分为单纯RA 组(n=62),其中男性9 例,女性53 例,患者平均年龄为54.68 ±10.40 岁;RA 合并肺间质病变(RA-ILD)组(n=50),其中男性20 例,女性30 例,患者平均年龄为60.16 ±9.02 岁。 另选取同期于西南医科大学附属医院进行体检的30 例健康人群作为健康对照组,其中男性15 例,女性15 例,平均年龄为48.87 ±15.19 岁。 本研究通过笔者医院医学伦理学委员会审批(伦理审批号：KY2021232)。 所有研究对象均签署知情同意书。

2.临床相关资料：(1)临床数据：性别、年龄、吸烟史、发病年龄、病程、压痛关节数、肿胀关节数、身高、体重。 (2)实验室结果：红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、抗环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide,CCP)抗体、类风湿因子(rheumatoid factor,RF)、抗突变型瓜氨酸波形蛋白(modified citrullinated vimentin,MCV)抗体、抗核抗体(antinuclear antibody,ANA)、白细胞(white blood cell,WBC)计数、血红蛋白(hemoglobin,Hb)、血小板(platelets,PLT)计数以及肺HRCT 等临床资料,并计算出体重指数(body mass index,BMI)、疾病活动指数(DAS28)等结果。

3.标本的采集以及血清DKK-1 浓度的检测：收集所有受试者清晨空腹静脉血3ml,待血液凝固后以2000r/min 离心,离心10min,评估标本合格后收集上清液,并存储于-40℃冰箱中备用。 使用武汉科鹿生物科技有限公司的人DKK-1 ELISA 试剂盒进行检测,按照操作步骤测定所有受试者血清中DKK-1 浓度。

4.统计学方法：使用R (Version 4.1.1; R Core Team, 2021)统计学软件对数据进行统计分析。 计数资料以频数(百分比)[n(%)]表示,组间比较采用χ2检验。 计量资料以均数± 标准差(x±s)表示,组间各特征的比较采用单因素方差分析、独立样本t检验。 采用Pearson分析评估变量之间的关联。 绘制受试者工作特征(receiver operator characteristic,ROC)曲线衡量DKK-1 在RA-ILD 中的诊断价值。 多因素二元Logistic回归分析RA 合并ILD 发生的独立危险因素。 以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.RA-ILD 组与单纯RA 组临床资料比较：临床数据中男性比例、吸烟史、年龄、发病年龄、压痛关节数、肿胀关节数比较,差异均有统计学意义(P均 ＜0.05)。 实验室结果中WBC、ESR、CRP 及DAS28 比较,差异均有统计学意义(P均 ＜0.05)。 RA-ILD组中抗CCP 抗体、RF 水平高于单纯RA 组,但差异均无统计学意义(P均＞0.05)。 病程、抗MCV 抗体、RF、Hb、PLT、ANA 水平、BMI 比较,差异均无统计学意义(P均＞0.05),详见表1。

表1 RI-ILD 组与单纯RA 组临床资料比较[n(%),±s]

表1 RI-ILD 组与单纯RA 组临床资料比较[n(%),±s]

项目单纯RA 组RA 合并ILD 组t/χ2P男性9(14.5)20(40.0)9.3670.002年龄(岁)54.68 ±10.4060.16 ±9.02-2.9400.004发病年龄(岁)46.79 ±11.6854.54 ±9.53-3.783＜0.001病程(年)7.86 ±10.315.69 ±7.821.2290.222吸烟史6(9.7)15(30.0)7.5030.006压痛关节数(个)9.40 ±4.1514.24 ±3.78-6.383＜0.001肿胀关节数(个)6.82 ±3.3710.74 ±3.76-5.804＜0.001 ESR(mm/h)57.26 ±31.8279.40 ±35.68-3.4670.001 CRP(mg/L)24.08 ±26.6747.95 ±47.25-3.1860.002 WBC(×109 /L)7.43 ±2.5810.11 ±8.56-2.1330.037 Hb(g/L)114.68 ±16.20115.32 ±20.37-0.1850.853 PLT(×109 /L)282.39 ±100.81314.18 ±141.72-1.3360.185 RF(IU/ml)238.81 ±246.25304.85 ±253.53-1.3920.167抗MCV 抗体(U/ml)591.92 ±417.48581.24 ±408.010.1350.892抗CCP 抗体(U/ml)312.68 ±185.02337.82 ±181.77-0.7200.473 ANA 阳性28(45.2)18(36.0)0.9590.327 BMI(kg/m2)23.15 ±3.9123.29 ±3.22-0.2010.841 DAS285.79 ±0.896.65 ±0.79-5.382＜0.001

2.RA-ILD 组与单纯RA 组以及健康对照组血清DKK-1 水平比较：RA-ILD 组中DKK-1 水平为42.17 ± 15.43ng/ml,高于单纯 RA 组(30.19 ±8.85ng/ml)以及健康对照组(17.38 ±6.78ng/ml),3组间比较,差异有统计学意义(F= 46.050,P＜0.001)。 组间两两比较,差异均有统计学意义(P均＜0.05)。

3.DKK-1 水平对于诊断RA-ILD 价值分析：DKK-1 水平检测RA 合并ILD 患者的敏感度和特异性分别为46.0% 和96.8% (曲线下面积=0.727),此时最佳临界值为45.108ng/ml,敏感度与特异性分别为46.0%与96.8%。

4.DKK-1 与临床变量的相关性分析：Pearson相关分析结果显示,DKK-1 水平与发病年龄(r=0.208,P= 0.028)、压痛关节数(r= 0.267,P=0.004)、肿胀关节数(r=0.212,P=0.025)、ESR(r=0.287,P=0.002)、DAS28(r=0.284,P=0.002)均呈正相关(P均＜0.05),详见表2。 与性别、年龄、病程、BMI、CRP、RF、抗CCP 抗体、ANA 水平、抗MCV抗体、白细胞计数、血红蛋白、血小板计数均无相关性(P均＞0.05)。

表2 DKK-1 与各个指标相关性分析

5.多因素二元Logistic回归分析：以患者是否合并肺间质病变为因变量对患者进行多因素Logistic回归分析,结果显示压痛关节数目及DKK-1 水平与RA 合并ILD 相关,是其发生的危险因素,女性是RA-ILD 发生的保护因素(P＜0.05),详见表3。

表3 RA 患者中合并ILD 影响因素的多因素Logistic 回归模型

讨 论

类风湿关节炎是一种常见的风湿性疾病,我国RA 患者中约有10.32% 发生肺间质病变,而世界范围内仅为3.34%[9]。 研究表明,RA 合并ILD 的患者具有较高的病死率,并且RA-ILD早期临床症状不典型,容易漏诊,且部分ILD 早于关节症状出现,所以及时发现对RA-ILD 的治疗对RA-ILD 患者的预后具有重要意义,目前关于RA-ILD 的病因尚不清楚,认为RA-ILD 的发病与遗传易感性和环境因素相关[10]。 RA 合并ILD 患者的肺部病理表现分为两个阶段,早期为炎症免疫反应阶段,可表现为肺泡炎,后期为肺纤维化阶段,由于成纤维细胞病灶中肌成纤维细胞的激活导致细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积增加,最终导致不可逆性肺间质纤维化[11,12]。

DKK-1 可通过与受体LRP6 结合,抑制经典Wnt 通路的活化,影响相应的生物学功能[13]。 Ⅱ型肺泡上皮细胞(type 2 alveolar epithelial cells,AEC2)是肺泡细胞中的干细胞,抑制DKK-1 的表达可以促进Ⅱ型肺泡上皮细胞的增殖,并减弱PM2.5 诱导的小鼠肺纤维化[14]。 Zhou 等[15]研究发现,降低DKK-1 的表达,可以阻断成纤维细胞的活化并改善特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)。 既往研究发现,DKK-1 在IPF 患者肺组织中表达增强,能够改变Wnt 诱导的上皮细胞增殖[6]。 与其他自身免疫性疾病所致的ILD 不同在于,RA-ILD 与IPF 具有相似的风险因素,以及影像学和病理学相似表现,并且它们预后差,中位生存期相似[16]。 上述研究表明,DKK-1 可能与RA 发生ILD 相关。

目前国内外已有多项研究发现DKK-1 参与了RA 的发病,对RA 的诊断以及评估患者疾病活动度具有一定的参考价值[5,17]。 然而关于RA 合并ILD患者血清中DKK-1 水平变化的研究较为少见。 Jing等[18]研究发现,血清中DKK-1 在RA-ILD 组中的表达明显升高,对识别RA-ILD 患者具有一定敏感度和特异性,在RA-ILD 中具有一定的预测价值。本研究发现,RA 合并ILD 患者血清中DKK-1 表达水平亦升高明显,且与单纯RA 组比较,差异有统计学意义,提示DKK-1 可能参与了RA 发生ILD 的过程。 DKK-1 水平检测RA 合并ILD 患者的敏感度和特异性分别为46.0% 和96.8%,曲线下面积=0.727,此时最佳临界值为45.108ng/ml,95% CI：0.627 ～0.826,提示DKK-1 可能参与了ILD 的发生,对RA-ILD 具有一定诊断效能,可考虑与其他生物学指标联合检测以提高诊断效能。

目前已经确定了RA 患者发生ILD 的几个危险因素,包括高龄、男性、吸烟、CCP 抗体或RF 阳性,并且一些研究表明RA 疾病活动度、吸烟是可预防的危险因素[10,19]。 本研究中RA-ILD 组男性例数多、年龄大、吸烟率高,且差异有统计学意义(P＜0.05),提示男性、高龄、吸烟可能与RA 并发ILD 相关,这与既往文献报道相符合[19]。 本研究中RA-ILD 组中RF、抗CCP 抗体水平高于单纯RA 组,但差异无统计学意义,考虑可能纳入的RA 患者非初治患者相关。单因素分析差异有统计学意义变量进一步纳入多因素Logistic回归模型中,以探索RA 患者中出现合并ILD 的相关危险因素,结果发现,压痛关节数以及DKK-1 是影响RA 患者并发ILD 的独立危险因素,女性是ILD 发生的保护因素,而年龄、吸烟、抗CCP 抗体、RF 均未纳入多因素回归分析中,提示可能与样本量偏少以及多种因素影响有关。

既往研究发现,RA-ILD 组的患者与单纯RA 患者比较,ESR、CRP 等炎性指标明显升高[21]。 本研究亦发现,RA-ILD 患者血清中ESR、CRP 均高于单纯RA 组,且差异有统计学意义(P＜0.5)。 在一项纳入1419 例RA 患者的研究中,疾病活动度越高的RA 患者发生ILD 的风险越高[22]。 本研究同样发现,DKK-1 水平与ESR、DAS28 均呈正相关(P均＜0.05),并且RA-ILD 组DAS28、ESR 明显高于单纯RA 组,差异有统计学意义(P＜0.05),进一步说明DKK-1 在RA-ILD 的发生、发展中具有重要的作用,提示DKK-1 可反映RA 疾病活动度,积极控制类风湿疾病活动度可以降低发生肺间质病变的风险。

本研究的不足之处在于：①研究样本量不足;②不同试剂盒的敏感度以及准确度不同;③受试者未进行肺功能的检测。 以上的不足之处可能导致本研究与其他研究存在一定的差异。

综上所述,DKK-1 参与了RA 的形成,在RA-ILD 的发生、发展中可能具有一定的作用,对于疾病活动度高、男性、DKK-1 表达水平高的患者尽早进行影像学检查评估是否合并ILD。 但关于DKK-1在RA-ILD 中的作用机制有待于扩大样本量开展深入研究,为RA-ILD 患者提供新的治疗靶点。