基于网络药理学和分子对接探讨加味四妙勇安膏治疗急性放射性皮炎的作用机制

苑忠霞，宋凤丽，廖子玲，胡汉琼，刘 珂

(1. 北京中医药大学,北京 100029;2. 北京中医药大学第三附属医院,北京 100029)

放射治疗是恶性肿瘤综合治疗的主要手段，但放射线在杀伤肿瘤细胞的同时也会损伤靶区内正常皮肤组织[1]。急性放射性皮炎(a-RISR)是放射治疗常见的并发症，伴有皮肤红斑、脱屑、疼痛、发热、瘙痒、溃疡和出血等不适[2]，制约着肿瘤放射治疗的完成。西医主要以药物治疗为主，包括重组人表皮生长因子、三乙醇胺乳膏、维生素B12等，但临床疗效有一定的局限性[3]。众多医家认为，放射线为外来之邪，其性属热，与中医燥热邪气致病特点相似。a-RISR可归属于中医学“疮疡”“烧伤”“烫伤”等范畴[4]。四妙勇安汤为“清热解毒”的经典方剂，主治热毒炽盛之脱疽，现代临床上广泛用于治疗周围血管病、糖尿病足及皮肤病变等多种疾病[5]。北京中医药大学第三附属医院肿瘤血液科长期从事中医药防治恶性肿瘤及其并发症的研究，对四妙勇安汤进行加减化裁后自拟加味四妙勇安膏，前期研究表明加味四妙勇安膏对a-RISR有较好的防治作用，考虑与抑制炎症反应、促进血管生成等机制有关[6-8]。本研究拟运用网络药理学[9]进一步探究加味四妙勇安膏作用于a-RISR的关键成分、靶点及通路，并结合分子对接技术加以验证，为外用加味四妙勇安膏治疗a-RISR的后续研究提供思路。

1 资料与方法

1.1加味四妙勇安膏成分及作用靶点筛选 加味四妙勇安膏成分为金银花90 g、玄参90 g、当归60 g、黄芪30 g、连翘30 g、蒲公英30 g、紫草30 g、甘草10 g、冰片10 g。运用中药系统药理学数据库和分析平台[10](TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)分别检索加味四妙勇安膏中药物的化学成分。由于加味四妙勇安膏为外用制剂，故根据药代动力学特性及相关文献，以ADME参数中DL(类药性)≥0.18和1

1.2a-RISR作用靶点筛选 以“acute radiation induced skin reaction”为关键词在GeneCards数据库[15](https://www.genecards.org/)、OMIM数据库[16](https://omim.org/)中筛选a-RISR作用靶点。在GeneCards数据库中，将得分大于中位数的靶点作为a-RISR潜在作用靶点。将上述2个数据库中获得的所有靶点进行汇总去重后得到a-RISR基因靶点。

1.3药物-疾病交集靶点PPI网络构建及核心靶点筛选 运用Microsoft Excel软件将药物与疾病基因靶点取交集，并通过在线工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)绘制维恩图。将交集靶点提交到STRING数据库(https://www.string-db.org/)构建PPI网络，将生物种类设定为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设定为“highest confidence”(>0.9)，并隐藏游离的靶点，得到靶点相互作用网络及其TSV文件。将TSV文件导入Cytoscape v3.7.2进行度值分析，构建PPI可视化网络图。运用Cytoscape软件中的CytoNCA插件对蛋白互作网络节点中心性进行分析和评估，以筛选核心作用靶点。筛选参数包括Betweenness Centrality(BC)、Closeness Centrality(CC)、Degree Centrality(DC)、Eigenvector Centrality(EC)、Local Average Connectivity-based method Centrality (LAC)和Network Centrality(NC)。参数值均满足大于中位值的靶点为核心靶点。

1.4GO和KEGG富集分析 将交集靶点输入Metascape[17](http://metascape.org/gp/index.html)完成GO和KEGG富集分析，GO和KEGG富集分析包含GO生物过程(GO biological process)、GO分子功能(GO molecular function)、GO细胞成分(GO cellular components)和KEGG途径(KEGG pathway)，将物种限定为“Homo sapiens”，选择“custom analysis”,同时将条件设定为“P Value Cutoff=0.01”,“Min Overlap=3” and “Min Enrichment=1.5”，并通过在线工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)对富集结果进行可视化处理。

1.5成分-靶点-通路网络构建及核心成分筛选根据KEGG富集分析得到的通路对应靶点，结合靶点对应的活性成分，运用cytoscape 3.7.2构建成分-靶点-通路可视化交互网络图，并通过NetworkAnalyzer插件进行网络拓扑分析判断核心作用成分，分析参数包括连接度(Degree Centrality)、介度(Betweenness Centrality)和紧密度(Closeness Centrality)。其中节点代表有效成分、作用靶点和KEGG富集通路，边代表它们之间的相互作用关系。

1.6分子对接验证 通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取小分子配体的2D结构，将2D结构输入ChemOffice软件对结构进行优化并转换为3D结构，保存为mol2文件；运用RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/)获取靶蛋白的晶体结构，通过PyMOL软件将核心靶蛋白的晶体结构进行删除水分子和有机物等处理，保存为PDB文件。采用AutoDockTools软件把小分子配体和蛋白晶体结构保存为PDBQT文件并确定活性口袋。最后，在命令提示符里运行vina分子对接，并将结果通过PyMOL软件进行可视化处理。

2 结 果

2.1加味四妙勇安膏成分及作用靶点 在TCMSP数据库中根据DL≥0.18和1

表1 加味四妙勇安膏中DL值排名前30的化学成分

2.2a-RISR作用靶点 从GeneCards数据库和OMIM数据库中分别检索到6 743和500个a-RISR基因靶点。根据相关度中位值对GeneCards数据库中获得的基因靶点进行3次筛选后得到843个作用靶点。将所有靶点进行汇总去重后共得到1 263个a-RISR基因靶点。

2.3药物-疾病交集靶点PPI网络及核心作用靶点 将药物和疾病靶点取交集并绘制韦恩图，得到164个交集靶点，见图1。将交集靶点提交到STRING数据库，隐藏未连接的靶点后下载TSV文件并将其提交到Cytoscape v3.7.2以获得PPI可视化网络，见图2。运用CytoNCA进行网络拓扑分析，见图3，得到STAT3、TP53、EP300、MAPK3、AKT1等蛋白互作网络核心靶点，具体参数值见表2。

表2 PPI网络拓扑分析核心靶点参数

2.4GO和KEGG富集分析 运用Matascape数据库对164个交集靶点进行GO和KEGG富集分析，并用水平条形图和气泡图可视化富集项，见图4及图5。首先，图4展示了加味四妙勇安膏治疗a-RISR主要参与的生物过程包括血管的发育(bloodvessel development)、凋亡信号通路(apoptotic signaling pathway)、对生长因子的反应(response to growth factor)等；同时，图4得到了细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、蛋白酶结合(protease binding)、蛋白质结构域特异性结合(protein domain specific binding)等分子功能条目，主要在膜筏(membrane raft)、囊泡腔(vesicle lumen)、蛋白激酶复合物(protein kinase complex)等细胞成分处发挥作用。KEGG富集结果包括p53信号通路(p53 signaling pathway)、Wnt 信号通路(Wnt signaling pathway)等。此外富集通路还包括VEGF信号通路(VEGF signaling pathway)、NF-κB信号通路(NF-kB signaling pathway)及PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)等。

2.5成分-靶点-通路网络构建及拓扑分析 网络由298个节点和1 637条边组成，从图中可以看出，同一靶点可以作用于多个通路，而不同的通路也可以被同一个靶点所影响，充分体现了中药多靶点、多通路的作用特点。在网络中，一个节点的连接度(degree)代表它连接其他节点所含的边数；通常认为一个节点的degree值越大，它发挥的作用越显著。基于网络拓扑分析，按degree值排名靠前的化合物有槲皮素(quercetin)、芹菜素(apigenin)和木犀草素(luteolin)等，排名前12的活性成分参数见表3。

表3 加味四妙勇安膏核心成分网络拓扑分析结果

2.6分子对接验证 核心成分网络拓扑分析中degree值排名前3的成分为槲皮素(quercetin)、芹菜素(apigenin)和木犀草素(luteolin)，运用CytoNCA对PPI网络进行运算筛选出的核心靶点中，按degree值排名前5分别为STAT3、TP53、EP300、MAPK3和AKT1，对其进行分子对接以评价活性成分和核心靶点的结合强度，结果见表4。模式图见图7，以槲皮素对接结果为例，其同STAT3、TP53、EP300、MAPK3和AKT1的结合能分别为-6.1，-7.4，-8.2，-8.3和-5.9 kJ/mol，可通过ASP-369、LYS-383、HIS-437、ASN-491和STAT3形成氢键，通过ASN-165、ARG-156、ILE-159、GLU-128、LYS-130和TP53形成氢键，通过ASN-1132、TYR-1089、GLN-1077和EP300形成氢键，通过ARG-87、GLY-186、GLN-83、ARG-84和MAPK3形成氢键，通过MET-140和AKT1形成氢键。配体(关键成分)和受体(核心靶点)的结合能数值为负说明二者可以自发结合，数值≤-5 kJ/mol认为配体与受体结合良好[19]，数值≤-7 kJ/mol提示有较强的活性和稳定性，且数值越低，提示两者的结合活性就越好[20]。分子对接结果提示关键成分和核心靶点的结合能数值均低于-5 kJ/mol，说明3种关键成分和核心作用靶点具有较强的结合力和稳定性。

表4 关键成分与核心靶点分子对接结果

3 讨 论

近年来，随着肿瘤发病率的增加和放射治疗的日益普及，放射线往往会对受照射区域皮肤组织造成不同程度的损伤。尽管西医治疗在临床上可以取得一定的效果，但仍未建立起针对a-RISR的标准化治疗方案。中国传统医学在皮肤疾病治疗方面有独特优势，尤其是在改善症状方面，大量临床研究和动物实验也证明中医药在防治a-RISR方面有很好的疗效。雷丽等[21]对紫白黄芪膏防治乳腺癌术后胸部照射所致放射性皮炎的疗效展开研究，发现紫白黄芪膏能有效延缓放射性皮肤损伤出现的时间，促进皮损愈合，降低放射性皮炎的级别。段紫钰等[22]应用双草膏对大鼠放射性皮炎模型展开研究，结果发现，双草膏能抑制炎症因子表达，减轻皮肤损伤，考虑与阻断TLR4/MyD88/NF-κB信号转导有关。丁彤晶等[23]通过对中医外治法治疗a-RISR疗效进行Meta分析，结果提示在促进皮损愈合及改善患者症状等方面均表现出一定的积极作用。

本研究通过构建成分-靶点-通路网络图进行拓扑分析，根据度值初步筛选出加味四妙勇安膏治疗a-RISR的关键成分有槲皮素、芹菜素和木犀草素等。槲皮素为天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌及心血管保护等广泛药理作用[24]。动物实验表明槲皮素能够降低成纤维细胞对TGF-β的收缩性，减轻放射线引起的皮肤纤维化，改善小鼠放射性皮肤损伤[25]。芹菜素具有抑制氧化应激、减轻炎症反应等作用，能通过激活Akt/Nrf2通路、下调NF-κB表达以促进深Ⅱ度烧伤大鼠创面愈合[26]。木犀草素具有较强的DNA保护、抗氧化、抗炎及紫外线吸收特性，体内外实验发现木犀草素能上调人体皮肤前列腺素E2、环氧酶-2的产生，可以干扰MAPK通路以减轻紫外线引起的皮肤红斑。故槲皮素、芹菜素、木犀草素可能为发挥关键作用的活性成分。

通过对PPI网络进行拓扑分析，得到STAT3、TP53、EP300、MAPK3和AKT1等核心作用靶点。STAT3为信号传导和转录激活因子(STAT)家族的一员，在特应性皮炎、皮肤肿瘤、银屑病等多种皮肤疾病的发生发展中发挥重要作用。皮肤主要由表皮细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等构成，最新研究表明TGF-β-STAT3通路可能与成纤维细胞的活化相关，给予STAT3敲除后小鼠成纤维细胞-TGF-β刺激后发现可以减少胶原分泌、降低成纤维细胞分化能力，故STAT3抑制剂很可能成为临床加快皮损修复的药物[27-28]。TP53为抑癌基因p53的突变型，参与细胞凋亡和细胞周期停滞。TP53无法停止受损DNA复制，可能会引起角质细胞恶性转化和克隆增生[29]。组蛋白乙酰转移酶EP300可通过染色质重塑调节转录，在细胞增殖分化过程中起重要作用。研究表明，过度表达的KLF4可通过协同EP300介导银屑病患者皮损中KRT17的过度表达，引起炎性反应及表皮细胞周期异常等病理变化[30]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是将信号从细胞表面传导到细胞核内的关键传递者，MAPK3为其成员之一。杜伟斌等[31]通过大鼠实验，发现电针扬刺手法可抑制p38 MAPK通路过度活化,发挥抑制炎症因子表达、促进创面修复等作用。AKT家族分别有AKT1、AKT2、AKT3三个成员，AKT1活性降低可导致丝聚蛋白表达和加工减少，引起特应性皮炎小鼠皮肤屏障功能受损[32]。因此，STAT3、TP53、EP300、MAPK3和AKT1可能是加味四妙勇安膏活性成分作用于a-RISR的核心靶点。

对交集靶点进行GO和KEGG富集分析后，得到p53信号通路、Wnt信号通路，还包括VEGF信号通路、NF-κB信号通路及PI3K-Akt信号通路等。p53和Wnt信号通路均参与调控细胞凋亡过程。研究发现，放射线引起的皮肤损伤创面细胞氧化应激状态可引起细胞过度凋亡，为皮肤溃疡形成发展的关键因素[33]。放射性皮肤损伤存在辐射后微血管损伤现象，VEGF等血管生成介质能促进血管内皮细胞的有丝分裂、细胞增殖及迁移等，通过调节VEGF信号通路可以对辐射后损伤组织的修复发挥重要作用[34-35]。刘鑫等[36]运用四妙勇安汤对尾动脉血管吻合术后吻合口再狭窄大鼠模型进行干预，结果表明，四妙勇安汤能调节VEGF蛋白水平变化，加快血管修复。NF-κB被证实在调控炎症反应中起关键作用，何卫东等[37]构建竹叶青蛇伤动物及细胞模型，研究结果表明NF-κB信号通路为竹叶青蛇伤血管内皮细胞炎症损伤的关键。李光辉等[38]开展细胞实验发现四妙勇安汤及其单体可通过抑制NF-κB p65mRNA的表达来减少血管内皮细胞P-选择素的表达；而P-选择素在白细胞与内皮细胞的黏附中起重要作用。PI3K/Akt通路是一条经典的信号通路，与增殖、分化和凋亡相关。王晓妮等[39]通过大鼠实验发现松萝酸可能调节PI3K/Akt通路以减轻大鼠皮损炎性反应，从而促进创面愈合。故推测加味四妙勇安膏可能通过调节p53信号通路、Wnt信号通路、VEGF信号通路、NF-κB信号通路和PI3K-Akt信号通路等发挥调节炎症反应、促进血管新生、调控细胞凋亡等作用以加速损伤组织愈合。

分子对接结果表明，加味四妙勇安膏的关键活性成分槲皮素、芹菜素和木犀草素同核心靶点STAT3、TP53、EP300、MAPK3和AKT1的结合能数值均小于-5 kJ/mol，说明均具有较高的药效活性。以上结果提示关键成分可能通过作用于以上潜在核心靶点发挥治疗a-RISR的作用。

综上所述，本研究基于网络药理学及分子对接验证，预测加味四妙勇安膏有效成分槲皮素、芹菜素、木犀草素等通过与STAT3、TP53、EP300、MAPK3和AKT1等核心靶点相互作用，调节p53信号通路、Wnt信号通路、VEGF信号通路、NF-κB信号通路、PI3K-Akt信号通路等发挥调节炎症反应、改善血管损伤、促进胶原纤维形成等治疗作用促进皮损组织愈合，符合中药多成分、多靶点、多途径的特点。本研究对阐明加味四妙勇安膏治疗a-RISR的机制具有参考意义，但选择不同的算法可能会产生不同的预测结果，且药物和疾病之间存在量效关系，疾病的发生、药物的发展和药效过程也是动态变化的，故该结论有待进一步的体内外实验和临床研究验证。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。