狼源产气荚膜梭菌的分离鉴定及分子分型

董秀梅，李秀云，刘 念，杨 巍，邓爱怀，吕文鹏，关春宇，张 萍，邹希明*，师东方*

（1.东北农业大学动物医学学院/农业部动物疫病病原生物学重点实验室东北科学观测实验站，黑龙江 哈尔滨 150030；2.哈尔滨北方森林动物园，黑龙江 哈尔滨 150322）

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）广泛分布于土壤、污水、饲料和动物肠道中，该菌可导致动物的坏死性肠炎、肠毒血症，也可以导致人腹泻和食物中毒等疾病[1-2]，是一种重要的人兽共患病原菌。产气荚膜梭菌的致病作用与其分泌的20 多种外毒素及酶类相关，依据其分泌的主要毒素α、β、ε和ι，可将其分成A（α）、B（α、β、ε）、C（α、β）、D（α、ε）和E（α、ι）5 种毒素型[3]。其中α 毒素由染色体定位的cpa基因编码，所有毒素型的产气荚膜梭菌均可产生α 毒素。产气荚膜梭菌在厌氧条件下8 h即可进入对数生长期，并分泌大量毒素，因此由该菌引起的疾病具有发病急、病程短的特征，患病动物往往因来不及救治而死亡，因此给养殖业带来重大经济损失。国内外研究报道发现，产气荚膜梭菌病在不同国家和地区的畜禽养殖场中广泛存在，且A 型是主要的毒素型。同时发现该菌也是造成野生动物如东北虎、非洲狮、犀牛、驯鹿、羊驼等急性死亡的主要病原菌[4-9]。但关于狼感染产气荚膜梭菌引起急性死亡的病例尚未见报道。

狼（Canis Lupus）属于食肉目犬科犬属，在我国属国家二级保护野生动物。我国曾是狼种群最大的国家之一，但因生存环境的破坏以及人为大量扑杀，导致狼群的数量急剧减少。目前，野外生存的狼群只在北纬30 度以北地区存在。城市中的狼主要集中于国内少数野生动物园，数量较少。2020 年9 月15日清晨，黑龙江省某动物园饲养员在狼散放区内发现5 匹死狼，并在附近地面发现呕吐物及血性腹泻物。当日下午，又陆续有2 匹狼死亡，其中1 匹狼死前抽搐，剖检可见下颌皮下组织出血性胶样浸润、颌下淋巴结出血，全身脏器浆膜大面积出血。结合流行病学调查、临床症状及病理剖检变化初步诊断该狼群为梭菌感染引起的急性死亡。为了进一步确定造成狼群死亡的病原菌生物学信息，本研究采集急性死亡狼心血、肝、脾、颌下淋巴结样品，分离鉴定了一株A 型产气荚膜梭菌，并对其药物敏感性、MLST 分型以及致病性进行分析，为狼感染产气荚膜梭菌的防治提供了理论依据，也为野生动物梭菌性传染病的诊断与防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源、实验动物及主要试剂病料样品为黑龙江省某动物园散放区急性死亡狼的心血、肝脏、脾脏及颌下淋巴结各1 份。6 周龄清洁级昆明鼠（18 g～22 g，雌性）购自辽宁长生生物技术股份有限公司。鲜血琼脂培养基、强化梭菌鉴别琼脂（DRCA）、液体硫乙醇酸盐培养基（FT）、含铁牛奶培养基、厌氧袋、厌氧产气包等均购自青岛海博生物科技有限公司；细菌生化微量鉴定管、药敏片购自杭州微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；DL8000 DNA Marker、pMD18-T 载体、DH5α 感受态细胞购自TaKaRa 公司；PCR Master Mix 购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 细菌分离培养将采集的心血、肝脏、脾脏及颌下淋巴结分别经抹片、染色、镜检初步判定为病原菌后，将上述病料样品分别划线接种于鲜血琼脂培养基和DRCA 培养基，置于厌氧袋中，37 ℃培养18 h～24 h，观察菌落形态特征，挑取可疑菌落经涂片染色镜检后纯培养。纯培养后的细菌接种于FT 液体培养基增菌，以便进行后续的生化试验及毒素鉴定。

1.3 分离菌的生化鉴定将纯化后的分离菌接入微量生化反应管（葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、乳糖、木糖、甘露醇、MR、吲哚试验、水杨苷、含铁牛奶培养基、还原性硝酸盐试验及明胶液化）中，37 ℃厌氧培养24 h～48 h，参照产品说明书判定结果。

1.4 分离菌16S rRNA 及毒素基因的PCR 扩增及序列分析以提取的分离菌全基因组DNA 为模板，采用16S rRNA 通用引物，经PCR 扩增分离菌的16S rRNA 基因。PCR 产物与pMD18-T 载体连接后转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞， PCR 鉴定的阳性克隆由吉林库美生物科技公司测序，并参照梭菌属中常见菌株的16S rRNA 序列，利用BLAST 比对分析其序列同源性和构建进化树。同时参照文献[10]中PCR 方法扩增分离菌株α 毒素（cpa基因编码）、β 毒素、B2毒素、CPE 毒素、ε 毒素、ι 毒素、NetB 毒素的基因。

1.5 分离菌的多位点序列分型（MLST）参照文献[11]中PCR 方法扩增产气荚膜梭菌的8 个管家基因（colA-groEL-sodA-plc-gyrB-sigK-pgk-nadA），PCR 产物纯化后由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，利用PubMLST 数据库（https://pubmlst.org/organisms/clostridium-perfringens）分别查找比对等位基因，确定分离菌的ST 型。

1.6 分离菌的药敏试验采用K-B 纸片扩散法检测分离菌药敏性。取100 μL 菌液均匀涂布于DRCA 培养基，将药敏片贴于培养基表面后，置于厌氧袋中37 ℃培养24 h，测量抑菌圈直径，依据CLSI 抗菌药物敏感性试验标准判定结果。

1.7 分离菌的致病性试验将42 只昆明鼠随机均分为7组，将分离菌液10倍倍比稀释后（5.21×105cfu/mL～1.52×109cfu/mL）分别按0.2 mL/只腹腔接种6 组实验组，对照组以0.2 mL/只腹腔接种FT 液体培养基。每天观察并记录小鼠发病及死亡情况，连续观察7 d。利用Karber 法计算分离菌对小鼠的LD50。无菌剖检死亡小鼠，再次分离并鉴定致病菌，取肝脏、脾脏、肠等组织于4%多聚甲醛中固定，制作组织病理切片观察。

2 结 果

2.1 细菌的分离培养结果取病死狼的脏器组织抹片、染色、镜检，分别在心血、颌下淋巴结以及肝脏（图1A）抹片中观察到两端钝圆，单个或成短链排列的革兰阳性粗大杆菌。经鲜血琼脂培养基厌氧培养后可见圆形、灰白色、有双溶血环的菌落（图1B）；在DRCA 培养基上可见圆形、黑色菌落（图1C）。革兰染色镜检可见与脏器抹片相同的菌体特征（图1D）。分离菌的培养和染色特性与产气荚膜梭菌相似，初步表明分离菌可能为产气荚膜梭菌。

图1 狼肝脏细菌革兰染色及分离培养Fig.1 Gram staining,isolation and culture of the bacteria from wolf liver tissue

2.2 分离菌生化试验结果生化试验结果显示，分离菌的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、甲基红试验、硝酸盐还原试验和明胶液化均呈现阳性，而果糖、木糖、甘露醇、吲哚试验和水杨苷结果呈阴性，动力试验呈阴性，在含铁牛奶培养基中培养5 h后大量产气，呈现严重的爆裂发酵现象。将生化试验结果与《伯杰细菌鉴定手册》对比分析后显示，该分离菌与产气荚膜梭菌的生化试验结果一致。进一步表明分离菌为产气荚膜梭菌。

2.3 分离菌16S rRNA基因序列及毒素分型序列的测定结果以分离菌提取的基因组DNA为模板，PCR扩增结果显示其16S rRNA 基因与预期大小（1 421 bp）一致（图2A）；序列分析结果显示分离菌16S rRNA 基因序列与产气荚膜梭菌相应基因序列同源性达99%以上，但与梭菌属中的其他菌株存在较大差异（图2B）。进化树结果显示，分离菌16S rRNA基因序列与产气荚膜梭菌聚类。综合分离菌的染色、培养特性和生化试验结果，表明分离菌为产气荚膜梭菌，命名为C.perfringensHLJ15-2。PCR 检测C. perfringensHLJ15-2 的毒素基因结果显示，仅检测到cpa；测序分析结果显示，该扩增产物与产气荚膜梭菌cpa序列同源性达99.65%。表明C.perfringensHLJ15-2毒素型为A型。

图2 分离菌16S rRNA基因的PCR扩增（A）及系统进化树（B）结果Fig.2 Results of 16S rRNA gene amplification(A)and phylogenetic tree(B)of the isolate

2.4 分离菌MLST分型结果利用MLST方法对C.perfringensHLJ15-2 进行基因分型，通过8 个管家基因colA、groEL、sodA、plc、gyrB、sigK、pgk、nadA的测序结果分析获得各个等位基因的编号分别为74、63、1、4、25、60、1、13，进而确定C.perfringensHLJ15-2为ST 221 型，该型菌为鸡源产气荚膜梭菌。推测本次疫情可能为狼食用鸡制品感染该菌所致。

2.5 分离菌药敏试验结果C.perfringensHLJ15-2 药敏试验结果显示，该分离菌对磺胺类抗菌药、喹诺酮类抗菌药敏感；对四环素类抗生素、多肽类抗生素以及β-内酰胺类抗生素中的头孢拉定、氨苄西林耐药（表1），表明C.perfringensHLJ15-2具有多重耐药性。

表1 C.perfringens HLJ15-2的药敏试验结果Table 1 Drug sensitivity test of the C.perfringens HLJ15-2

2.6 分离菌小鼠致病性试验结果利用昆明鼠进行C.perfringensHLJ15-2 的致病性试验，结果显示2.76×108cfu/mL、1.52×109cfu/mL 菌液组小鼠在感染后12 h内全部死亡，6.30×107cfu/mL 菌液组小鼠在感染后18 h 内死亡5 只，1.86×107cfu/mL 菌液组小鼠在感染后24 h 内死亡2 只，其余小鼠直至7 d 未见死亡，对照组未出现发病和死亡情况。经计算C. perfringensHLJ15-2 的LD50为2.26×107cfu/mL。剖检实验组死亡小鼠可见肠道臌气，黏膜出血。肝、脾轻微肿大、充血。取实验组小鼠肝、脾进行细菌分离培养及鉴定，再次分离到A 型产气荚膜梭菌。

组织病理学观察可见小鼠肠绒毛断裂，黏膜固有层上皮细胞增生、黏膜下层红细胞增多、充血、炎性细胞浸润（图3A）；肝内各级血管淤血，肝细胞条锁状排列消失，体积肿大，肝细胞核浓缩、溶解，胞浆内出现大小不等的空泡，部分肝细胞溶解（图3B）；脾红髓比例增加，白髓部分细胞坏死（图3C）。由上述结果可见，由狼脏器内分离的A 型产气荚膜梭菌对小鼠具有致病性，小鼠均在感染后24 h 内死亡，且死亡小鼠剖检可见与狼群感染产气荚膜梭菌引起急性死亡的症状基本一致，表明该分离菌具有强致病性。

图3 感染小鼠组织病理切片观察Fig.3 Observation of pathological tissue sections of infected mice

3 讨 论

产气荚膜梭菌分布广泛，可产生多种毒素，对人和动物的健康造成严重危害。其中仅分泌α 毒素的A 型产气荚膜梭菌是动物和人食源性感染的主要毒素型。有研究报道α 毒素能突破血脑屏障，侵害延髓，破坏呼吸系统及心脏的传导系统，从而导致动物“猝死症”的发生[12-13]。本研究首次分离鉴定了一株狼源A 型产气荚膜梭菌，涉及的患病狼均呈急性死亡，与之前报道的野生动物急性死亡病例相似，但由于狼属于国家二级保护野生动物，无法开展本动物致病性试验，因此本研究利用小鼠对分离菌进行致病性分析，结果表明本次发生的狼急性死亡与A 型产气荚膜梭菌感染密切相关。

由于产气荚膜梭菌是肠道内的常在菌，可引起内源性感染。为了明确本次感染的来源，对新分离的菌株进行了MLST 分型，通过对其8 个管家基因的测序、比对，确定了其为ST 221 型，属于鸡源产气荚膜梭菌。ZHANG 等人报道的产气荚膜梭菌引起东北虎和狮子死亡的病例中认为高蛋白饮食及未完全解冻的鸡肉是产气荚膜梭菌的主要来源[9]。而在以往的报道中发现，无论在鸡的养殖还是屠宰环节，A型产气荚膜梭菌均是最常被分离到的毒素型。司南等从多地区采集的549 份迁徙候鸟样品中分离鉴定了42 株产气荚膜梭菌，均为A 型菌，另外从养鸡场分离鉴定了多株产气荚膜梭菌，A型菌分离率高达90%以上[14]。Li 等报道了从北京和山西地区的猪群、鸡群采集的620 份粪便样品中分离鉴定了322 株产气荚膜梭菌毒素型均为A 型[15]。 A 型菌在禽类感染中处于主要地位。因此推测本次疫情可能与狼饲喂鸡制品有关，可见给肉食动物饲喂禽类制品时存在一定的风险，应在饲喂前明确禽制品的来源，必要时应进行细菌学的监测，防止类似事件的发生。

关于野生动物源的产气荚膜梭菌的药敏试验报道较少。Silva 等报道了从野生肉食动物和鸟类分离的菌株对氟苯尼考、甲硝唑、青霉素和万古霉素普遍敏感，对红霉素、泰乐菌素和土霉素耐药[16]。而本研究分离的产气荚膜梭菌对氟苯尼考、头孢呋辛钠、头孢噻肟、磺胺甲基异恶唑、阿莫西林、环丙沙星、诺氟沙星等敏感。由MLST 分型表明，本研究分离的产气荚膜梭菌为鸡源菌，在一些报道中发现，养鸡场以及屠宰场中分离的产气荚膜梭菌对多种抗生素耐药，基本集中在多黏菌素、四环素、氯霉素、氨苄西林等药物的耐药，与本研究分离菌的耐药性基本一致[17-18]，也进一步印证了MLST 的分型结果。

本研究是我国首次报道狼群感染A 型产气荚膜梭菌与急性死亡相关的病例，分离菌株C. perfringensHLJ15-2 主要生物学特性的研究结果丰富了野生动物产气荚膜梭菌感染的生物学信息，为该病的诊断与防治提供了实验依据。