北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫层析试纸条的研制及初步应用

李宛生，李敏华，张洪亮，李 超，许 浒，付 军，龚帮俊，郭镇洋，刘建波，彭金美，周国辉，王 倩*，田志军*

（1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069；2.北京爱德士元亨生物科技有限公司，北京 101318）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由PRRS 病毒（PRRSV）引起的一种以妊娠母猪繁殖障碍以及仔猪呼吸系统障碍为主要特征的高度接触性传染病[1]。国际病毒分类委员会（ICTV）最新分类已将PRRSV 的两个基因型分别划分到动脉炎病毒属的两个亚属之中，欧洲型（PRRSV-1）和北美型（PRRSV-2）的种名分别重新命名为Betaarterivirus suid 1和Betaarterivirus suid 2[2]，这意味着对这两类不同病原的检测、监测和疫病的防控要区分开来。有研究报道中国流行的PRRSV 遗传和变异多样性持续增加[3-4]，结合我国主要以公司加农户的养殖模式，开发一种快速、特异、简便、适合现地初筛的检测方法，对监测我国PRRSV 的流行和疫病防控至关重要。

PRRSV 多为亚临床感染，致其感染宿主的临床特征不明显，大多需通过实验室检测手段确诊。目前，最常用的检测方法是PCR，该方法针对病毒保守基因设计引物，准确性和敏感性较高，但也存在一些缺点，如PRRSV 较易变异需要及时更新引物，操作过程较为耗时，易发生气溶胶污染，需要专业的设备和人员，检测成本较高，限制了其在现地的推广和应用[5]。免疫层析试纸条（Immunochromatographic strip，ICS）是一种以纤维素膜为载体的新型检测技术，与PCR 方法相比，ICS 方法是以特异性的抗体作为免疫检测“探针”，检测的靶标是病毒蛋白，更方便、快速、特异、安全无污染，检测结果更加可信，不需要专业的技术人员或昂贵的设备，更适用于现地检测[6]。

目前，以胶体金为示踪剂检测PRRSV 或其抗体的ICS 已经有相关报道[7-9]。虽然胶体金试纸条体系已较为成熟，但限于胶体金颗粒自身特性原因，其稳定性及敏感性低于乳胶微球等新型示踪剂[6]，且基于乳胶微球作为示踪剂检测PRRSV 抗原的ICS 方法尚未报道，因此本研究将PRRSV 单克隆抗体（MAb）与乳胶微球偶联，将其作为结合垫上的检测抗体，同时将该MAb 作为检测线上的捕获抗体，建立检测PRRSV 的乳胶微球ICS 方法，为现地PRRSV 的流行病学调查及临床检测提供了新的技术手段。

1 材料与方法

1.1 病毒及临床样品北美型PRRSV：高致病性PRRSV（HP-PRRSV）HuN4-F5 株[10]、NADC30-like SDHS 53 株、NADC34-like TZJ1341 株，欧洲型PRRSV DV疫苗株、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2 型（PCV2）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪细小病毒（PPV）、PRRSV N 蛋白MAb 1H4[11]、pCold-GST质粒和13 份不同PRRSV 感染的猪血清样品均由本实验室保存；108 份疑似PRRSV 感染的临床猪血清及肺组织样品于2020 年采自东北地区部分养殖场。

1.2 主要试剂E. coliBL21（DE3）感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；Protein G 树脂及层析柱购自金斯瑞生物科技有限公司；Lighting Cloning Kit 购自北京博奥龙免疫技术有限公司；GST Foocurose 4FF Kit 购自武汉汇研生物科技股份有限公司；直径300 nm 的红色乳胶微球、乙磺酸（MES）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）均购自Thermo 公司；硝酸纤维素膜（NC 膜）购自Millipore 公司；结合垫购自Pall 公司；吸水垫和聚氯乙烯（PVC）板条购自上海金标生物技术有限公司；羊抗鼠IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司；DyLightTM800 羊抗鼠IgG购自KPL 公司；TIANamp Virus RNA Kit 购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 PRRSV 重组N 蛋白（rN）的表达、纯化及鉴定参考GenBank 中北美型PRRSV SDHS53 株（MH 651744.1）的N 基因，利用Oligo 6.0 软件设计引物（SDHS53-F：CATATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATG CCAAATAACAACGGCAGACAGC/SDHS53-R：GAGAT TACCTATCTAGACTGCAGGTCGACTCATGCTGAGGGT GACGCTGTG）。利 用TIANamp Virus RNA Kit 提 取SDHS53 株基因组RNA，反转录为cDNA 后作为模板，采用上述引物扩增N 基因片段，利用Lighting Cloning Kit 利用同源重组法将该片段克隆至pCold-GST 载体中构建重组质粒pCold-GST-SDHS53-N，将重组质粒转化E. coliBL21（DE3）感受态细胞，16 ℃低温诱导表达，富集菌液超声处理后，经SDS-PAGE检测rN 的表达。采用GST Foocurose 4FF 纯化rN，经SDS-PAGE 检测纯化效果，利用BCA 法测定其蛋白浓度，以纯化的MAb 1H4（1∶1 000）为一抗，以Dy-LightTM800 羊抗鼠IgG（1∶10 000）为二抗，经western blot 鉴定rN 与MAb 1H4 的反应性。纯化的rN 用于后续ICS 的敏感性试验。

1.4 ICS 各反应条件的优化及建立

1.4.1 与红色乳胶微球偶联的最佳MAb 即检测抗体浓度的优化 乳胶微球的活化及其与不同浓度N 蛋白MAb 1H4（0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL及3.0 mg/mL）的偶联均参照卢福庄等[12]的方法，最终获得不同浓度红色乳胶微球MAb 1H4 的偶联物。将不同浓度的偶联物用XYZ3050 点喷系统以3 μL/cm 分别喷在结合垫上，作为检测抗体，37 ℃干燥处理；将MAb 1H4 用PBS 稀释至2.0 mg/mL，喷在NC 膜的检测线（T 线）上作为检测线捕获抗体，将羊抗鼠IgG用PBS 稀释至1.0 mg/mL 喷在NC 膜的质控线（C 线）作为质控线捕获抗体，37 ℃干燥1 h，经含3%的脱脂乳封闭1 h，PBST 洗涤3 次，室温干燥后4 ℃保存备用；最后将制备好的4 部分：带加样孔的样品垫、含有检测抗体的结合垫、含有检测线捕获抗体及质控线捕获抗体的NC 膜、末端的吸水垫，依次两两重叠组装在PCV 板条上即为ICS，检测PRRSV 细胞培养上清液和未接毒细胞对照上清液各5 份，观察显色情况，确定与乳胶微球偶联的最优MAb 即检测抗体的浓度。

1.4.2 检测线捕获抗体浓度的优化 检测线捕获抗体MAb 1H4 用PBS 稀 释 成1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL 和3.0 mg/mL 5 种不同浓度，将质控线捕获抗体羊抗鼠IgG 浓度统一为1.0 mg/mL，使用XYZ3050 点喷系统以1 μL/cm 的流速喷在NC 膜上，按照1.4.1 将最优浓度的偶联乳胶微球的MAb 喷在结合垫上，再按照1.4.1 所述方法组装为ICS，检测PRRSV 细胞培养上清液和未接种病毒的细胞上清液各5 份，观察试纸条显色情况，确定最优的检测线捕获抗体的浓度。

1.4.3 质控线捕获抗体羊抗鼠IgG 浓度的优化 将质控线捕获抗体即羊抗鼠IgG 分别稀释成0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL 和2.0 mg/mL 4 种不同浓度，将检测线捕获抗体MAb 的浓度统一为2.0 mg/mL，使用XYZ3050 点喷系统以1 μL/cm 的流速喷在NC 膜上，将最优浓度的检测抗体喷在结合垫上，再按照1.4.1所述方法制备成ICS，检测PRRSV 细胞培养上清液和未接种病毒的细胞上清液各5 份，观察试纸条显色情况，确定最优的质控线捕获抗体浓度。

1.4.4 ICS 的建立、组装及结果的判定 将活化的红色乳胶微球与最优浓度的MAb 1H4 偶联后喷在结合垫上做为检测抗体，将最优浓度的MAb 1H4 喷在NC 膜的检测线上做为检测线捕获抗体，将最优浓度的羊抗鼠IgG 喷在NC 膜的质控线上作为质控线捕获抗体。然后按照1.4.1 将样品垫、结合垫、NC 膜、末端的吸水垫依次组装在PCV 板上，各组分相互重叠2 mm，连同保护外壳和干燥剂一起组装在包装盒中，即为检测PRRSV 的ICS。使用时，将待检样品加入加入检测孔中，静止5 min～15 min 判定结果。

1.5 ICS 的特异性试验利用制备的ICS 分别检测HP-PRRSV HuN4-F5 株、NADC30-like SDHS53 株、NADC34-like TZJ1341 株、欧洲型PRRSV DV 疫苗株、CSFV、PRV、PCV2、PEDV、TGEV 和PPV，根据结果判定ICS 的特异性。

1.6 ICS 的敏感性试验将HP-PRRSV HuN4-F5（106.0TCID50/mL）和rN（24 000 ng/mL）分别用PBST和PBS 系 列 稀 释（105.0TCID50/mL、104.0TCID50/mL、103.0TCID50/mL、2.5×103.0TCID50/mL、103.0TCID50/mL、5×102.0TCID50/mL、2.5×102.0TCID50/mL；24 000 ng/mL、2 400 ng/mL、 240 ng/mL、 120 ng/mL、 60 ng/mL、30 ng/mL、15 ng/mL、7.5 ng/mL、3.75 ng/mL），分别以DMEM 和PBS作为阴性对照，每个稀释度取100 μL用于ICS 检测，以能观察到条带的最大稀释浓度确定为该方法的敏感性。

1.7 ICS 的重复性试验取3 份PRRSV 阳性组织样品研磨液、2 份北美型PRRSV 和1 份Marc-145 细胞培养上清液，使用同一批次制备的ICS 进行批内重复试验，每个样品重复4 次，确定ICS 的批内重复性；选取不同批次制备的ICS 对上述样品进行批间重复试验，每个样品重复4次，确定ICS的批间重复性。

1.8 动物实验血清样品及临床样品的检测将13份不同PRRSV 感染实验猪的血清样品（分别为4 份HP-PRRSV HuN4 株、4 份NADC30-like SDHS53 株、5 份类高致病性PRRSV）及2020 年采自东北地区108份疑似PRRSV 感染的临床血清样品（18 份）及肺组织样品（90 份）（参照1.5 处理该类样品），参照张洪亮等建立的PCR 方法分别检测[13]，同时采用本研究建立的ICS检测，比较二者的检测结果并计算符合率。

2 结 果

2.1 PRRSV rN 的表达及鉴定结果将重组质粒pCold-GST-SDHS53-N 转化E. coliBL21（DE3）感受态细胞，IPTG 低温诱导，利用SDS-PAGE 检测。结果显示，在超声处理后的重组菌液上清中检测到了40 ku左右的目的条带，与预期相符。经GST Foocurose 4FF 亲和层析纯化后，虽然存在少量杂蛋白，但rN的纯化效果仍较好（图1A）；Western blot 结果显示，在40 ku 左右出现特异性条带（图1B）。BCA 测定结果显示，rN 的浓度为240 μg/mL。上述结果表明，获得了纯化效果较好的PRRSV rN，且与MAb 1H4 的反应原性较好。

图1 PRRSV rN表达的SDS-PAGE（A）及western blot（B）鉴定Fig.1 SDS-PAGE(A)and western blot(B)identification of PRRSV recombinant N protein

2.2 ICS 各反应条件的优化结果各反应条件的优化结果显示，MAb 1H4 的浓度为1.5 mg/mL 时，与乳胶微球的偶联效果较好，检出率最高，抗体消耗最少，为最优偶联乳胶微球MAb 即检测抗体的最优浓度；检测线捕获抗体MAb 1H4 的浓度为2.0 mg/mL时，质控线捕获抗体羊抗鼠IgG 的浓度为1.0 mg/mL时，检出率最高，检测线显色最强，抗体消耗最少，分别为最优的检测线捕获抗体和质控线捕获抗体的工作浓度。

2.3 ICS 的组装及结果的制定将样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫依次组装在PCV板上，并与保护外壳和干燥剂一起组装在包装盒中即为ICS（图2B）。使用时，将待检样品加入检测孔中（图2A），静止5 min～15 min，结果判定如图2C 所示。

图2 ICS的组装（A、B）及结果的判定（C）Fig.2 Composition(A,B)and result judgment criteria(C)of ICS

2.4 特异性试验结果利用制备的ICS 检测不同类型的PRRSV 和其他主要猪病病毒，结果显示，该ICS 与北美型PRRSV 中的HP-PRRSV HuN4-F5 株、NADC30-like SDHS53 株和NADC34-like TZJ1341 株均呈阳性反应，在相应检测线出现条带（图3A），与欧洲型PRRSV DV 疫苗株及猪的其他常见病毒均呈阴性结果（图3B），表明本研究制备的ICS 对北美型PRRSV 的检测具有广谱性，且特异性较强。

图3 ICS的特异性试验结果Fig.3 Specific test result of the strip

2.5敏感性试验结果将106.0TCID50/mL 的HPPRRSV HuN4-F5 株及rN 均做系列稀释后分别利用该ICS 检 测。结 果 显 示，ICS 对HP-PRRSV HuN4-F5 株的最低检测限为5×102.0TCID50/mL（图4A），对rN 的最低检测限为15 ng/mL（图4B），表明本研究制备的ICS敏感性较高。

图4 ICS对HP-PRRSV HuN4-F5株（A）及rN（B）的敏感性试验结果Fig.4 Sensitivity test results of ICS detection for high pathogenic PRRSV HuN4-F5 strains(A)and recombinant N protein(B)

2.6 重复性试验结果利用本研究建立的ICS 分别对3 份PRRSV 阳性组织样品研磨液、2 份PRRSV 和1份Marc-145 细胞培养上清分别进行批内和批间的重复性检测，结果显示，批内检测结果均一致，批间的检测结果也均一致（图略），表明本研究制备的ICS重复性较好。

2.7 ICS 的初步应用

2.7.1 猪血清样品的检测结果 分别采用本研究制备的ICS 和本研究室建立的PCR 方法[13]检测本实验室保存的13 份不同PRRSV 感染猪第21 d 的血清样品。结果显示，4 份HP-PRRSV HuN4 株感染的猪血清样品经ICS（图5A）和PCR 检测结果均为阳性，二者的符合率达100%；4 份NADC30-like SDHS53 株感染的猪血清样品，ICS（图5B）和PCR 检测结果均为阳性的2 份，ICS 检测为阴性、PCR 检测为阳性的2 份，二者的符合率为50%；5 份类HP-PRRSV 感染的猪血清样品，ICS（图5C）和PCR 检测结果均为阳性的3份，均为阴性的1 份，PCR 检测为阴性、ICS 检测为阳性1 份，二者符合率为80%。表明，本研究建立的ICS可以用于我国当前主要流行PRRSV感染猪血清的检测。

图5 不同北美型PRRSV感染猪血清样品的检测结果Fig.5 Detection results of swine serum samples infected by different North American-type PRRSV strains

2.7.2 临床样品的检测结果 采用该ICS 和本研究室建立的PCR[13]方法同时检测108 份临床猪血清样品（18份）和猪肺组织样品（90份）。ICS 结果显示，40份样品为阳性，68 份样品为阴性，阳性率为37.03%；PCR 结果显示，46 份样品为阳性，62 份样品为阴性，阳性率为42.59%，经统计学分析，ICS 与PCR方法的总符合率为83.33%（表1）。表明本研究建立的ICS 方法可以用于检测临床样品。

表1 ICS与PCR对临床样品检测结果的比较Table 1 Comparison of the results of clinical samples detection by ICS and PCR

3 讨 论

PRRS 是最重要的动物传染病之一，给世界养猪业造成了严重的经济损失，快速、敏感、准确的诊断可以极大防制PRRSV 在猪群内的传播。常规PCR方法漏检和误检时常发生，且检测周期长，专业性强，总体检测成本较高，而ICS 体系已比较成熟，基于不同标记示踪剂的ICS 已广泛应用于生物医学或食品安全检测以及各种动物疫病的监测[6]。

基于不同的标记示踪剂和PRRSV蛋白，国内外学者已经建立了多种检测PRRSV 或其抗体的ICS[7-9]，以针对核衣壳蛋白（N 蛋白）和膜蛋白（M 蛋白、GP5）等结构蛋白建立的方法居多，特别是ORF7 编码的N 蛋白高度保守，在相同基因型PRRSV 内的同源性较高，可达94%～100%，其含量高达PRRSV 蛋白总量的20%～40%，且免疫原性较强，是目前PRRSV 检测和免疫监测方法的主要靶结构蛋白之一[14]。李雪松等均以胶体金标记的PRRSV N 蛋白MAb 作为检测探针[15-17]，将另一株识别PRRSV N 蛋白不同表位的MAb和羊抗鼠IgG 抗体分别作为检测线和质控线建立的ICS，对PRRSV 的最低检测限均可达103.0TCID50/mL 左右，与RT-PCR 方法的符合率也在91%～95%，一致性较高，适合于现地筛查的推广应用。

随着我国PRRSV 流行态势的日益复杂多变，以NADC30-like 株和高致病性株为主要流行株，多种谱系病毒共存的局面已经形成，上述以胶体金为示踪剂的ICS 方法建立时间过久，均只适用于检测中国当时分离的流行株（经典株/高致病性株），且缺乏对目前我国当前主要流行株NADC30-like 和潜在流行株NADC34-like 以及其他谱系PRRSV 的检测效果评估。因此，本研究基于一株北美型PRRSV N 蛋白的广谱性MAb 1H4，将乳胶微球偶联的MAb 1H4 喷在结合垫上作为检测抗体，将MAb 1H4 喷在检测线上作为检测线捕获抗体，山羊抗鼠IgG 喷在质控线作为质控线捕获抗体，建立了一种敏感性高、特异性强、检测广谱且快速的ICS 方法。胶体金技术已较为成熟，但为了提高其检测的敏感性，本研究选用乳胶微球作为标记探针主要基于以下考虑：一方面，乳胶微球与MAb 通过共价偶联作用结合，比胶体金的静电吸附作用更稳定；另一方面，乳胶微球的粒径范围远大于胶体金颗粒，比表面积较大，可以结合更多的抗体，这就是乳胶微球探针的敏感性高于胶体金颗粒的原因[6]。结果显示，本研究制备的ICS 的敏感性高于国内已建立的ICS 方法[15-17]，对PRRSV 的最低检测限为5×102.0TCID50/mL，对N 蛋白的最低检测限为15 ng/mL；为了提高该ICS 方法的特异性，本研究利用针对PRRSV 免疫原性最强的N 蛋白MAb 1H4 作为检测抗体和检测线捕获抗体，早期报道表明，N 蛋白之间可以通过二硫键及非共价相互作用形成二聚体等高级结构，这也是本研究能够通过一株N 蛋白MAb 捕获并检测到PRRSV N 蛋白的理论基础[18]。该ICS 可检测我国目前出现的高致病性株、NADC30-like 株、NADC34-like 株等北美型代表性PRRSV，与欧洲型PRRSV 代表株DV 和其他常见猪病毒均无交叉反应，这也与前期研究MAb 1H4 识别的抗原表位在北美型PRRSV 中高度保守[11]的结果相符合。该ICS 方法对108 份临床样品的检测结果与PCR 方法的整体符合率为83.33%，符合率较高，但略低于国内已建立的PRRSV ICS 检测方法[15-17]。推测原因：一方面可能是方法间的差异所导致，两种方法检测的靶标不一样，PCR 侧重于检测病毒的核酸，ICS 侧重于检测病毒的蛋白，病毒核酸和病毒蛋白的含量并不相同，造成二者的检测结果有差异；另一方面可能是不同病毒株间差异所导致，本研究所检样品测序结果显示，NADC30-like 株感染的样品占比较高，而已有研究[15-17]所检测的样品主要是HPPRRSV 株流行时期的样品，而近年来NADC30-lik 株已取代HP-PRRSV 成为当前主要的流行株[19]，其致病力低于HP-PRRSV，且多数病毒株为中等致病力，其感染后的组织及血清中的病毒载量相对低于HP-PRRSV，这也可能是本研究方法与PCR符合率相对较低的原因；进一步利用该ICS 检测了不同类型PRRSV感染实验猪的血清，结果显示，HP-PRRSV 株感染21 d的猪血清PRRSV 的检出率高于NADC30-like株和类高致病PRRSV株，这与本研究室之前的推测一致。后续将进一步通过动物实验，比较不同类型PRRSV 株感染后猪血清中PRRSV 抗原含量的差异，为该方法提供更多的临床数据支持，但总体而言该ICS 可用于我国PRRSV 主要流行株的血清学检测，虽然该ICS 的敏感性低于RT-PCR，但该方法耗时更少，也无需专门的设备或专业人员，更适用于现地PRRSV 的大规模筛查。

综上所述，本研究首次建立了一种基于乳胶微球为示踪剂，以一株PRRSV N 蛋白MAb 同时作为检测抗体和检测线捕获抗体的ICS 方法，该方法简便快捷、成本低廉，具有良好的敏感性、特异性、重复性和检测的广谱性，具有较大的应用潜力，非常适合于现地PRRSV 的筛查。