开菲尔蛹虫草发酵乳保健饮料的研制

赵策朗 杜志文 郑 爽 张晨宇 秦秀丽

（吉林农业科技学院 吉林·吉林 132101）

蛹虫草是著名的食药用菌，其菌体内蛋白质含量丰富，氨基酸种类齐全，含有虫草素、虫草酸、虫草多糖、甘露醇、SOD、微量元素及维生素等多种生物活性物质，具有显著提高免疫力、抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳、补肺益肾、补虚损、益精气的作用[1-2]，以良好医疗保健等功效深受人们青睐，广泛用于食品、医药、保健等领域。

开菲尔是由乳酸菌与酵母菌等多种有益微生物形成的颗粒状结构的共生体，能够将牛奶中的乳糖经发酵获得乳酸、柠檬酸、少量的乙醇和CO2等多种代谢产物，同时获得细腻柔软的凝乳，形成独特开菲尔风味的乳酸饮料[3]，比普通发酵乳具有更丰富营养，并且具有降血压、降胆固醇、提高免疫力、缓解乳糖不耐症等功能[4-5]，因此开菲尔又被称为“健康饮品”。目前发酵乳制品多以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为发酵剂，以开菲尔为发酵剂生产的发酵乳制品在市场上还是凤毛麟角，开发开菲尔发酵乳饮料在我国具有广阔的市场前景。

目前开菲尔蛹虫草发酵乳饮料还没有相关报道，本试验对开菲尔蛹虫草发酵乳饮料工艺条件进行研究，为开菲尔蛹虫草发酵乳保健饮料的生产及开发提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌种：蛹虫草试管菌种（由我校生物与制药工程学院微生物实验室提供）。

开菲尔：开菲尔粒从陕西的西安，宏圣堂健康产品有限公司购买。原料乳：蒙牛纯牛奶（全脂灭菌乳）。

其它原料：葡萄糖、琼脂粉、KH2PO4、MgSO4、蔗糖酯、白砂糖、果胶、柠檬酸钠为市售及化学纯。

1.2 试验方法

1.2.1 蛹虫草菌种的活化：配制PDA加富斜面试管培养基，在无菌条件下，将蛹虫草菌种转接到培养基上，24℃条件下培养7d，选择菌丝萌发较快，菌丝长势旺盛，浓密无污染的试管菌种备用。

1.2.2 蛹虫草菌丝体的制备：配制蛹虫草液体发酵培养基，其配方为马铃薯200g（煮沸后过滤取汁），葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母浸粉10g，MgSO41.5g，KH2PO41.5g，pH值6.0，水1000mL。装入500mL三角瓶，装量为300mL，在120℃下灭菌30min，在无菌条件下接入蛹虫草斜面试管菌种后，放入24℃、转速为120r/min电热恒温振荡培养箱中培养7d，然后将菌丝体过滤出来，再用无菌水冲洗数次，放入容器打碎成糊状备用。

1.2.3 开菲尔发酵剂的活化：将冷藏的开菲尔粒取出，以纯牛奶为培养液，在纯牛奶中加入5%蔗糖，以1∶10（开菲尔∶牛奶，g/mL）比例混合，然后在28℃下培养24h，按上述操作连续多次培养活化，直到形成新颗粒为止[6]。

1.2.4 开菲尔蛹虫草发酵乳的工艺流程：原料乳预热60℃→混合（加入蛹虫草菌丝、白砂糖、蔗糖酯）→均质（65℃、20Mpa）→杀菌（95℃、5min）→冷却（28℃左右）→接种（开菲尔发酵剂）→发酵(温度、时间)→冷却→无菌灌装→成品→感官评价及质量检测。

1.2.5 开菲尔蛹虫草发酵乳的单因素试验

（1）制作发酵乳制品，要加入适量的稳定剂，使乳酸凝固物稳定，改变产品的硬度和黏度。本试验以蔗糖酯为稳定剂，在原料乳中加入5%的白砂糖和15%的蛹虫草菌丝体，再分别添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的蔗糖酯，按照上述工艺流程进行操作，接入8%的开菲尔发酵剂，在30℃下培养24h，以沉淀率为指标，确定开菲尔蛹虫草发酵乳中蔗糖酯适宜的添加量。

（2）在原料乳中加入5%白砂糖和0.6%蔗糖酯，再分别添加5%、10%、15%、20%、25%的蛹虫草菌丝体，按照上述工艺流程进行操作，开菲尔发酵剂接种量、培养温度、时间与（1）相同，以感官评分和酸度为指标，确定开菲尔蛹虫草发酵乳中蛹虫草菌丝体适宜的添加量。

（3）在原料乳中加入15%的蛹虫草菌丝体和0.6%蔗糖酯，再分别添加2%、4%、6%、8%、10%的白砂糖，按照上述工艺流程操作。开菲尔发酵剂接种量、培养温度、时间与（1）相同，以感官评分和酸度为指标，确定开菲尔蛹虫草发酵乳中白砂糖适宜添加量。

（4）在原料乳中加入15%蛹虫草菌丝体、6%白砂糖、0.6%蔗糖酯，按照上述工艺流程操作，分别接入2%、4%、6%、8%、10%开菲尔发酵剂，培养温度、时间与（1）相同，以感官评分和酸度为指标，确定开菲尔蛹虫草发酵乳中开菲尔发酵剂适宜接种量。

（5）在原料乳中加入15%蛹虫草菌丝体、6%白砂糖、0.6%蔗糖酯，按照上述工艺流程进行操作，开菲尔发酵剂接种量、培养时间与（1）相同，分别在20℃、25℃、28℃、30℃、35℃下培养，以感官评分和酸度为指标，确定开菲尔蛹虫草发酵乳最适的发酵温度。

（6）在原料乳中加入15%蛹虫草菌丝体、6%白砂糖、0.6%蔗糖酯，按照上述工艺流程进行操作，开菲尔发酵剂接种量、培养温度与（1）相同，分别培养12h、16h、20h、24h、28h，以感官评分和酸度为指标，确定开菲尔蛹虫草发酵乳最适的发酵时间。

1.2.6 开菲尔蛹虫草发酵乳正交试验：在单因素试验基础上，以开菲尔接种量、蔗糖添加量、发酵温度、发酵时间为试验因素，设计L9（34）正交试验，确定开菲尔蛹虫草发酵乳饮料最佳工艺条件。

1.2.7 沉淀率和酸度的测定方法：沉淀率的测定方法参考文献[7]；酸度的测定方法参考文献[8]，采用吉尔涅尔度（°T）。

1.2.8 感官评分标准：开菲尔蛹虫草发酵乳的感官评定参照GB19302-2010《食品安全国家标准发酵乳》[9]，选8名具有食品感官评分经验的员按表1进行打分，取平均值，确定最佳因素水平。

表1 开菲尔蛹虫草发酵乳饮料感官评分标准Table1 sensory scoring standard of kefir Cordyceps militaris fermented milk beverage

1.2.9 微生物学检验：按照GB 19302-2010发酵乳食品安全国家标准进行微生物学检测[9]。

2 结果与分析

2.1 蔗糖酯添加量对开菲尔蛹虫草发酵乳品质的影响

沉淀率越小，说明发酵乳的稳定性越高。由图1可知，不同浓度的蔗糖酯添加量对开菲尔蛹虫草发酵乳稳定性是不同的。

图1 蔗糖酯添加量对开菲尔蛹虫草发酵乳稳定性的影响figure1 effect of sucrose ester on the stability of kefir Cordyceps militaris fermented milk

随着蔗糖酯添加量的增加，沉淀率呈现先降后升的趋势，当蔗糖酯添加量为0.6%时达到最小，制得的发酵乳的组织状态均匀细腻，凝集性较好。确定蔗糖酯添加量为0.6%时开菲尔蛹虫草发酵乳稳定性最佳。

2.2 蛹虫草菌丝体添加量对开菲尔蛹虫草发酵乳品质的影响

由图2可知，不同菌丝体添加量对开菲尔蛹虫草发酵乳品质有一定的影响。随着蛹虫草菌丝体添加量的增加，感观评分曲线开始逐渐上升，当添加量达到15%时感官评分最高，然后随着添加量增加，感官评分曲线逐渐下降。从乳酸度的曲线可以看出，曲线呈现平稳的下降趋势，表明菌丝体的添加量对乳酸度的影响不大，在制作开菲尔蛹虫草发酵乳饮料选择15%菌丝体添加量。

图2 蛹虫草菌丝体添加量对开菲尔蛹虫草发酵乳品质的影响figure2 effect of mycelium addition on the quality of kefir Cordyceps militaris fermented milk

2.3 白砂糖添加量对开菲尔蛹虫草发酵乳品质的影响

由图3可知，白砂糖添加量对开菲尔蛹虫草发酵乳品质有较大影响。随着白砂糖添加量的增加，感官评分和乳酸度二条曲线都呈现先升后降的趋势，当添加量为4%时乳酸度最高，此时发酵乳的口感较酸，感官评分不高，当添加量达到6%时，乳酸度降低，但感官评分最高，发酵乳酸甜适中，口味最佳。当白砂糖添加量超过6%时，发酵乳的酸度和感官评分逐渐下降。

图3 白砂糖添加量对开菲尔蛹虫草发酵乳品质的影响figure3 effect of white granulated sugar on the quality of kefir Cordyceps militaris fermented milk

分析其原因主要是当白砂糖添加量不足时，乳酸菌的产酸量低，粘度较差，当白砂糖添加量过大时，原料中的渗透压增高，抑制乳酸菌的生长繁殖，使酸乳的粘度下降。因此在正交试验中选择4%、6%、8%为白砂糖添加量的三个水平。

2.4 开菲尔接种量对开菲尔蛹虫草发酵乳品质的影响

由图4可知，开菲尔接种量对开菲尔蛹虫草发酵乳品质有较大的影响。随着开菲尔接种量的增加，乳酸度逐渐增加，当接种量为6%时，感官评分最高，当接种量超过6%后，乳酸度增加较快，口感酸味越来越重，感官评分也越来越低。分析其原因主要是随着接种量的增加，开菲尔中乳球菌分解乳糖产乳酸量越来越多，当接种量达到6%时，发酵乳饮料酸甜适中，口感较好。当乳酸度较高时，造成凝乳中蛋白质脱水收缩严重，使乳清析出，出现分层，同时较多的接种量，会导致大量的酵母菌体早衰和自溶，产生发酵臭，从而影响开菲尔的风味[4]。因此在正交试验选择4%、6%、8%为开菲尔接种量的三个水平。

图4 开菲尔接种量对开菲尔蛹虫草发酵乳品质的影响figure4 effect of kefir inoculation amount on the quality of kefir Cordyceps militaris fermented milk

2.5 发酵温度对开菲尔蛹虫草发酵乳品质的影响

由图5可知，发酵温度对开菲尔蛹虫草发酵乳品质有较大的影响。随着发酵温度的升高，发酵乳的感官评分先快速升高后略有下降。当发酵温度为30℃时感官评分最高，当超过30℃时感官评分略有下降，但从感官评分曲线上看，当温度为28℃和35℃时，与30℃时感官评分接近，变化不大。乳酸度曲线一直呈上升趋势。分析其原因主要是发酵温度低，乳酸菌的活力下降，凝乳能力降低，随着温度升高，乳球菌繁殖速度加快，代谢活性增强，乳糖分解产生大量的乳酸，使发酵乳的酸度不断升高。当温度为超过30℃时，感官评分达到最高。因此在正交试验中选择28℃、30℃、35℃为发酵温度的三个水平。

图5 温度对开菲尔蛹虫草发酵乳品质的影响figure5 effect of temperature on the quality of kefir Cordyceps militaris fermented milk

2.6 发酵时间对开菲尔蛹虫草发酵乳品质的影响

由图6可知，发酵时间对开菲尔蛹虫草发酵乳品质有较大的影响。随着发酵时间的延长，乳球菌分解乳糖产生的乳酸量增加，乳酸度曲线逐渐升温高，而感官评分曲线呈现先升后降的趋势，当发酵时间达到24h时感谢官评分最高，超过24h后，感官评分曲折线下降。分析其原因主要是由于发酵时间较长，乳酸度的过高，发酵乳的口感过酸。因此在正交试验中选择16h、20h、24h为发酵时间的三个水平。

图6 发酵时间对开菲尔蛹虫草发酵乳品质的影响figure6 effect of fermentation time on the quality of kefir Cordyceps militaris fermented milk

2.7 开菲尔蛹虫草发酵乳正交试验的结果及分析

在以上单因素试验基础上设计L9（34）正交试验，试验设计见表2，试验结果见表3。通过对试验结果的分析可知，最优组合为A2B2C2D3，即白砂糖的添加量为6%，开菲尔接种量为6%，发酵温度为30℃，发酵时间24h。正交试验结果极差R值可知，开菲尔蛹虫草发酵饮料品质影响主次因素为发酵温度＞B发酵时间＞开菲尔接种量＞白砂糖添加量。

表2 L9（34）正交试验设计Table2 L9（34)orthogonal experimental design

表3 L9（34）正交试验结果Table3 L9（34）orthogonal test results

3 产品的质量标准

3.1 感官指标

本产品的色泽为乳白色，具有光泽，具有发酵乳的香味，无异味，酸甜适口，组织均匀细腻。

3.2 理化指标

总固形物≥12%，蛋白质≥1.3%，酸度为65～80°T。

3.3 微生物学指标

大肠菌群：无检出；致病菌：无检出。

4 结论

通过试验确定开菲尔蛹虫草保健饮料生产的最佳工艺参数为蛹虫草菌丝体的添加量为15%，蔗糖酯添加量0.6%，白砂糖的添加量为6%，开菲尔接种量为6%，发酵温度为30℃，发酵时间为24h；L9（34）正交试验影响产品品质的主次因素为发酵温度＞发酵时间＞开菲尔接种量＞白砂糖添加量。本产品为乳白色或微黄色，组织细腻，酸甜适口，具有开菲尔发酵乳的独特风味。