结直肠癌肝转移灶的影像学特征与病理微形态学特点的关系

胡 赢，韦成江，龚 晗，赖 浩，赵 伟,2，冯 雁，林 源

“牛眼征”是结直肠癌肝转移灶独有的影像学特征，表现为增强CT门脉期肿瘤边缘环形强化而中心区低密度，而原发性肝癌少有这一特征[1-2]。大多数学者认为影像学“牛眼征”的出现与其供血方式有关[3-4]。也有研究显示，肿瘤病灶向正常组织过渡时其血流动力学发生明显改变[5]。目前评价肿瘤血管生成的“金标准”是微血管密度(microvessel density, MVD)[6]，是评估多种肿瘤预后不良的指标，如肺腺癌[7]、非小细胞肺癌[8]及结直肠癌[9]。肝转移瘤与原发性肝癌的微血管分布和组织密度差异尚未有明确研究。因此，本实验分析肝转移瘤与原发性肝癌中胶原纤维及CD31阳性微血管密度(CD31 positive microvessel density, CD31-MVD)的分布差异，探讨影像学“牛眼征”形成的可能机制。

1 材料与方法

1.1 病例收集收集2013年1月～2019年11月广西医科大学附属肿瘤医院就诊的32例结直肠癌肝转移患者及32例原发性肝癌患者的腹部增强CT资料，同时收集患者手术切除肿瘤组织标本蜡块和临床病理信息。

1.2 试剂兔抗人多克隆抗体CD31(ab28364)购自美国Abcam公司；即用型快捷免疫组化MaxVisionTM2检测试剂盒(KIT-5920)、DAB显色液及免疫组化抗原修复缓冲液(EDTA法)(MVS-0098)购自福州迈新公司；Sirius Red天狼猩红(S8060-5)购自北京索莱宝公司；苏木精(71020784)购自国药集团化学试剂公司。

1.3 天狼星红染色组织蜡块3 μm厚连续切片，65 ℃烘烤6 h，二甲苯脱蜡，无水乙醇梯度水化，去离子水洗去残留的乙醇及其他物质，室温风干。天狼星红染色液A 4 ℃孵育过夜，次日室温复温30 min，去离子水洗去多余的染液，天狼星红染色液B细胞核染色30 s，流动水冲洗5 min，苏木精浸泡1 min，流动水冲洗。1%盐酸乙醇分化3 s，去离子水冲洗后浸入PBS反蓝，PBS冲洗，梯度无水乙醇脱水，二甲苯透明，晾干后封固。采用FAXtissue系统采集全景高清图像。

1.4 免疫组化按上述方法烘烤、脱蜡、水化，去离子水洗去残留乙醇，用EDTA法进行抗原修复，3%过氧化氢阻断内源性抗体，PBS冲洗，滴加一抗兔抗人CD31多克隆抗体(1∶100)4 ℃孵育过夜，次日室温复温30 min。根据即用型快捷免疫组化MaxVisionTM2检测试剂盒进行二抗孵育及DAB显色。苏木精浸泡30 s，后续步骤同天狼星红染色。

1.5 结果判读天狼星红染色：使用EVOS FL成像系统扫描成像系统(美国Thermo Fisher公司)对天狼星红染色切片进行扫描(4倍镜)。使用Image J软件计算不同组织切片肿瘤区和边缘区的平均光密度值(AOD值)，由两名医师独立判读，最终结果取两人平均值。

CD31-MVD：参照Weidner校正方法，任何被抗体染色的单个内皮细胞或细胞团，不管是否形成管腔，只要与周围微血管、肿瘤细胞和其他连接组织有清楚的界限，均判读为一个可计数的微血管。由两位病理科医师于10×40倍镜下在肿瘤边缘区、肿瘤区各取3个视野，取其平均值为MVD值。

1.6 影像学资料使用开源软件Syngo-FastView(https://www.siemens-healthineers.com/en-us/medical-imaging-it/syngo-special-topics/syngo-fastview)提取CT图像(CT检查使用Siemens Somatom Sensation 64层螺旋CT机)。肿瘤区影像出现边缘部分或完全强化，中心不强化或低密度则记为(+)，其他表现记为(-)。由两名影像专业中级以上职称医师阅片，按照定义标准对所有病例的影像资料进行判定并统计，两人结果一致时取该结果，结果不一致时由第三名中级以上职称医师进行最后判定。

2 结果

2.1 临床特征32例结直肠癌肝转移中，男性26例，女性6例；平均年龄(63.0±4.3)岁；病变位于结肠20例，直肠12例，原发灶直径(6.3±2.2)cm；有淋巴结转移14例，无淋巴结转移18例；有脉管内癌栓10例，无脉管内癌栓22例；肝转移灶单发16例，多发16例；肝内转移灶最大径(3.1±0.8)cm；术前CEA浓度(6.9±0.6)ng/mL。32例原发性肝癌中，男性22例，女性10例；平均年龄(57.0±3.8)岁；肿瘤直径(4.7±1.2)cm；有脉管内癌栓12例，无脉管内癌栓20例；术前AFP浓度(533±43.8)μg/mL。

2.2 影像学“牛眼征”阳性率比较“牛眼征”主要见于结直肠癌肝转移患者，在原发性肝癌中较少出现，两组患者比较差异有统计学意义(P<0.05，图1，表1)。

图1 CT示：A.结直肠癌肝转移患者“牛眼征”阳性；B.原发性肝癌患者“牛眼征”阴性

表1 结直肠癌肝转移、原发性肝癌影像学“牛眼征”对比分析[n(%)]

2.3 胶原纤维在结直肠癌肝转移与原发性肝癌边缘区与肿瘤区的分布差异天狼星红染色结果显示：原发性肝癌肿瘤边缘区较肿瘤区的胶原纤维分布更密集(图2A、B)，而结直肠癌肝转移两个区域的胶原纤维分布较为接近(图2C、D)。通过对天狼星红显色强度(AOD值)进行定量分析发现，原发性肝癌边缘区染色强度高于肿瘤区，差异有统计学意义(P<0.05)，结直肠癌肝转移边缘区的染色强度稍高于肿瘤区，但差异无统计学意义(P>0.05)。组间比较结果显示：结直肠癌肝转移患者肿瘤区染色强于原发性肝癌肿瘤区染色，差异有统计学意义(P<0.05)，但在边缘区两者染色强度相似，差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

表2 结直肠癌肝转移、原发性肝癌边缘区与肿瘤区天狼星红染色AOD值对比分析

图2 原发性肝癌、结直肠癌肝转移灶天狼星红染色：A.肝癌原发灶边缘区；B.肝癌原发灶肿瘤区；C.肝转移瘤边缘区；D.肝转移瘤肿瘤区

2.4 CD31-MVD在结直肠癌肝转移与原发性肝癌中边缘区与肿瘤区的分布差异通过对不同区域的CD31-MVD进行计数发现，结直肠癌肝转移患者边缘区的CD31-MVD高于肿瘤区，差异有统计学意义(P<0.05)；原发性肝癌组边缘区与肿瘤区的CD31-MVD相似，差异无统计学意义(P>0.05)。组间比较结果显示：结直肠癌肝转移组边缘区和肿瘤区的CD31-MVD均较原发性肝癌组高，差异有统计学意义(P<0.05，表3，图3)。

表3 结直肠癌肝转移、原发性肝癌边缘区与肿瘤区CD31-MVD统计分析

图3 原发性肝癌及结直肠癌肝转移边缘区、肿瘤区CD31染色，MaxVision法：A.肝癌原发灶边缘区；B.肝癌原发灶肿瘤区；C.肝转移瘤边缘区；D.肝转移瘤肿瘤区

3 讨论

原发性肝癌和肝转移瘤这两种恶性肿瘤几乎囊括了绝大部分常见的肝脏恶性肿瘤。两者在影像学特征上具有非常明显的差别[10]。本实验比较了两者影像学特征的不同，与其胶原纤维和CD31-MVD之间的关系。

胶原纤维是结缔组织中分布最广、含量最多的一种纤维，且肿瘤的硬度、包膜均与结缔组织有关，在肝脏慢性疾病中如肝硬化、肝恶性肿瘤中均可出现胶原纤维等构成的细胞外基质所形成的纤维化[11-13]。本文作者首先考虑是否是组织密度差异造成了血流速度差异，继而导致显影剂滞留造成了“牛眼征”。通过天狼星红染色标记胶原纤维的分布发现，无论是在原发性肝癌或结直肠癌肝转移外周均包绕着密集分布的胶原纤维带，且半定量分析结果显示两者差异无统计学意义(P>0.05)，且结直肠癌肝转移边缘区与肿瘤中间区的胶原纤维均有较强表达。根据胶原纤维定量分析和影像学表现，作者推测肿瘤中的胶原纤维含量和分布可能并不能引起其影像学的特征性表现。

血供的差异亦是影像学“牛眼征”的形成原因。本实验采用免疫组化法对微血管标志物CD31进行检测发现，结直肠癌肝转移肿瘤边缘区微血管分布多于肿瘤其他区域，原发性肝癌中微血管在边缘区及肿瘤其他区域的分布基本一致。作者推测微血管的这种分布差异是否影响了血流分布范围，导致造影剂聚集在血流丰富区从而在CT影像上表现为强化带，或其影响血流速度造成造影剂分布的时差性，使得不同时期肿瘤组织与正常组织、肿瘤周边与肿瘤中心区域出现不同血流比例和造影剂比例，从而在CT影像上表现为不同的强化程度，形成“牛眼征”。而原发性肝癌边缘区与肿瘤区微血管密度的一致性及其供血主要来源于小动脉，使其在CT影像上表现为“快进快出”的影像学特点。

综上所述，结直肠癌肝转移瘤影像学的特征性表现可能与肿瘤周围的胶原纤维分布无直接联系；微血管在肿瘤边缘区、肿瘤区的差异性分布可能是引起结直肠癌肝转移、原发性肝癌的影像学特征性表现差异的原因之一，并且在一定程度上为现有的观点提供了理论依据。本实验影像学特征与病理微形态学改变的对比研究给了我们许多新的启发，但关于结直肠癌的病理微形态学与其临床现象和规律之间的关系，还有待我们进一步深入研究。