B等位基因新突变导致B抗原弱表达1例*

李小薇 李慧敏 宁义平 白晓莹 李翠莹

在人类血型系统中ABO血型系统的抗原性最强，是最复杂、最具多态性的血型系统之一，ABO 血型鉴定的准确性直接关系到患者输血治疗的安全[1]。除正常ABO血型外还存在着ABO亚型和受病理、生理等因素影响的ABO正反定型不符的血型表现，部分病例依靠血清学无法准确区分。基因检测方法能够克服以上血型血清学检测局限，结果判断更加客观，逐渐成为准确判断疑难血型必不可少的重要辅助手段[2]。本文分析了1例弱B抗原样本的血清学结果和基因检测结果，报告如下。

对象与方法

1对象 2021年12月就诊于本中心妇产与生殖医学科门诊患者1例。女性，41岁，乙肝患者，诊断阴道出血、贫血等，既往无输血史，送输血科进行血型和不规则抗体筛查。

2仪器与试剂 抗-A、抗-B单克隆抗体（批号：20200912，上海血液生物医药有限责任公司），抗-H抗体（批号：8000258203，荷兰Sanquin公司）；ABO反定型细胞（批号：202108002，江苏力博医药生物技术股份有限公司）；血型鉴定凝胶卡（批号：202108006，江苏力博医药生物技术股份有限公司）；核酸提取试剂（批号：21072810T148，西安天隆科技有限公司）、人类红细胞ABO血型基因分型试剂盒（SSP荧光PCR染料法）（批号：K202106003）、人类红细胞ABO血型-B亚型基因分型试剂盒（SSP荧光PCR染料法）（批号：K210311001）（天津市秀鹏生物技术开发有限公司）；dNTP-Buffer工作液（天津市秀鹏生物技术开发有限公司）；Taq酶（美国Promage公司）。核酸提取仪NP968-C（西安天隆科技有限公司），基因扩增仪LifeECO（杭州博日科技有限公司），通用型电泳仪JY300C（北京君意东方电泳设备有限公司），测序仪ABI 3130xl（美国ABI公司）。

3方法

3.1ABO血型血清学鉴定：使用微柱凝集法及盐水试管法进行血清学方法的血型鉴定。

3.2DNA提取：按照试剂盒说明书提取血液标本DNA。调整DNA浓度至（30～50）ng/μL、A260/A280值为1.6～2.0。

3.3荧光定量PCR法检测ABO基因：进行ABO基因初筛和B亚型检测。严格按照试剂盒说明书操作。扩增条件如下，运行段：96℃ 2 min；96℃ 20 s，68℃60 s，5组循环；96℃ 20 s，65℃ 50 s，72℃ 45 s，10 组循环；96℃ 20 s，62℃ 50 s、72℃ 45 s，15组循环；72℃延伸 1 min。熔解段：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，台阶温度1℃，台阶恒温时间20 s。

3.4ABO基因测序：对该例样本，分别进行ABO基因第1～7外显子测序和B基因单链测序，以确定突变位点以及突变点所在基因位置。委托天津秀鹏生物公司根据GENE BANK提供的ABO基因序列信息（NG_006669.1）设计ABO基因第1至第7外显子的扩增引物（表1）以及B等位基因第7外显子的扩增引物（表2），测序引物与扩增引物一致。采用Sanger测序法，将目的片段进行扩增后，测序仪进行测序并读取结果。

表1 ABO基因第1至第7外显子的扩增引物

表2 B等位基因第7外显子的扩增引物

按照以下反应体系对ABO基因的第1至第7外显子，以及B等位基因第7外显子进行单独扩增：dNTPBuffer工作液 43.5 μL，Taq酶（5 units/μL）0.5 μL，特异性引物对（300nM）1.0 μL，DNA 5 μL，总体积50 μL。

反应程序如下：96℃ 2 min；96℃ 20 s，68℃60 s，5组循环；96℃ 20 s，64℃ 50 s，72℃ 90 s，10 组循环；96℃ 20 s，61℃ 50 s、72℃ 90 s，25 组循环；72℃延伸 5 min。扩增产物4℃保存。将扩增完成的产物使用2.5%琼脂糖凝胶进行鉴定，确定产物条带均一且亮度足够后，进行测序。

使用chromespro软件以及DNAMAN8.0软件将测序的.ab1序列与ABO基因参考序列（NG_006669.1）进行人工对比，参比dbRBC数据库（更新日期2017年12月）以及ISBT数据库（Names for ABO（ISBT 001）blood group alleles v1.1 171023）确定基因型。

结果

1ABO血型血清学检测结果 患者红细胞B抗原弱表达，抗-H 4+，同时血清中存在抗-A抗体，无抗-B抗体。4℃加强半小时后检测B抗原3+，仍为弱表达（表3）。

表3 患者ABO血型血清学检测结果

2荧光定量PCR法检测B亚型基因 按照ABO基因初筛试剂盒读板纸判读结果为B/O型，进一步使用B亚型试剂盒检测，按照读板纸判读结果为B/O型。

3ABO基因测序 根据NCBI网站提供的The Blood Group Antigen Gene Mutation Database综合结果判定（以ABO*A1.01为参考序列）：该样本ABO基因在ABO*B.01/ABO*O.01.01的基础上，存在外显子7的c.448 T＞C的杂合突变（图1A）。结合血清学结果分析，推测该突变可能位于B基因上，导致B抗原减弱。

为了进一步确定杂合突变所在基因，进行B基因单链测序，结果发现该样本第7外显子突变点在ABO*B.01的基础上，多了c.448 T＞C的突变，证明突变点位于B基因上，属新的未被数据库收录的B等位基因新突变（图1B）。

图1 新发现ABO血型等位基因的核苷酸突变

讨论

ABO血型系统中少数人群为ABO亚型，表现为抗原或抗体减弱，导致血清学ABO正反定型不一致，引起血型定型困难，影响临床输血的安全性和有效性。ABO基因编码区共有7个外显子，其中外显子6和外显子7分别编码45、230个氨基酸，是产生ABO亚型的主要基因突变区域，具有明确的血型血清学特点[3]。

本研究中患者血型血清学结果为ABO正定型检出弱B抗原，抗-H结果强凝集4+，反定型检出抗-A，无抗-B（表3），推测为B亚型，随后进行基因分型。B亚型基因分型结果显示患者为B/O型，但考虑到血型血清学检测结果为B抗原减弱，故怀疑存在试剂盒检测范围以外的罕见B亚型或者存在新的基因突变位点，导致B基因编码的氨基酸发生变化，从而使抗原表达减弱[4-6]。因此进行ABO基因外显子1-7测序，结果为ABO*O.01.01/ B-novel（c.448 T＞C）（图1A）；为进一步判断突变位点所在ABO基因，对B基因外显子7进行单链测序（图1B）。与ABO*B.01基因相比，患者B基因序列中第448位碱基发生了点突变T＞C，提示第150号氨基酸由酪氨酸（Tyr）突变成组氨酸（His）。该突变并未被NCBI和dbRBC数据库收录，本文为首次报道；血清学结果导致了B抗原表达减弱，具体机理尚不明确。为了解患者该B变异等位基因的来源，进一步可对其父母及其父母系3代做家系调查。序列已提交NCBI 国际基因数据库（GeneBank），获得登录号“BankIt2613623 BSeq#1 OP254132”，等待确认序列号。

联用血清学和分子生物学检测技术对ABO亚型的准确鉴定具有重要作用[7-9]。本研究提示输血工作人员在进行患者输血前，对于ABO血型正反定型不符的患者有必要联合应用两种方法学进行ABO血型鉴定，最大程度地保障患者临床输血安全，并发现等位基因的新变异[10-12]。利用分子生物学技术可以明确区分ABO血型正反定型不符是ABO亚型，还是受病理、生理等因素影响，明确疑难血型产生的原因。如果患者ABO血型正反定型不符是受病理、生理等因素影响，排除干扰因素后，考虑输注ABO同型血液成分[13-15]。本研究中患者B抗原减弱是由于B等位基因的新突变造成，因同型红细胞获取困难，如需输血，首选自体输血，其次考虑输注交叉配血相合B型或O型红细胞。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突