血清白介素-10、胸苷激酶1在急性淋巴细胞白血病患儿中的表达及与危险度分层的相关性

宋春艳 林云碧 雷庆龄 吕瑜 肖祖刚

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是一种恶性克隆性疾病，该疾病的发病机制复杂，临床多认为与基因改变、遗传因素等密切相关[1]。目前，临床对于ALL的治疗手段较多，包括化疗、造血干细胞移植及免疫治疗等，但ALL仍具有一定的复发及病死风险[2]。研究指出，临床依据ALL患儿病情、治疗反应等情况，可将患儿分为低危、中危和高危3种危险度分层，在治疗前进行充分的危险度分层，对于选择合理的治疗路径尤为重要[3]。因此，积极探讨分析与ALL患儿危险度分层相关的指标，有利于准确判断患儿病情，并为后续治疗提供新思路，更有助于后续治疗方案的优化。相关研究指出，细胞免疫功能在ALL的发生、发展过程中发挥关键性作用[4]。血清白介素（Interleukin，IL）-10是一种多细胞源、多功能的细胞因子，可参与调节细胞的生长与分化、炎性反应和免疫反应等病理生理过程，在急性白血病患者中存在明显异常[5]。另有研究指出，骨髓异常增殖与ALL发病有关[6]。胸苷激酶1（thymidine kinase 1，TK1）是一种在分裂的细胞内表达的激酶，可参与催化胸苷磷酸化补救途径，是细胞增殖的标志物，主要用于检测体内细胞异常增殖速度[7]。因此，结合IL-10、TK1与免疫功能、细胞增殖的关系，推测IL-10、TK1在ALL患儿中存在异常表达，且与患儿危险度分层存在一定的关系。基于此，本研究重点分析血清IL-10、TK1在ALL患儿中的表达及其与患儿危险度分层的相关性，为病情评估提供依据，并为后续ALL治疗提供新的靶点。

资料与方法

1样本量计算 参照下列样本量公式估算样本量：，其中n代表总样本量，P代表总体比例的估计值，δ代表总体比例估计值的容许误差；经查阅文献获取估计值，ALL发病率为0.35%，检验方式为双侧检验，α（检验水准）为0.05，μα取1.96，容许误差为1.5%，得出最小样本量为60例，以失访率为20%计算，则最少需要71例样本，故本研究共纳入100例患儿进行研究。

2一般资料 研究实施已获得医院伦理委员会的批准同意。选取2018年5月～2021年5月医院收治的100例ALL患儿作为研究对象，全部患儿家属对研究内容知情，且签署同意书。纳入标准：（1）ALL符合《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议（第四次修订）》[8]中相关诊断标准，且经骨髓象、血液检查等确诊；（2）年龄≤16岁；（3）新发ALL。排除标准：（1）伴有心、肝、肾等脏器功能不全；（2）伴有先天性心脏病；（3）既往有放疗、化疗和生物学治疗史；（4）合并其他恶性肿瘤；（5）继发性免疫缺陷病；（6）伴有唐氏综合征；（7）合并其他血液系统疾病和自身免疫性疾病的患儿；（8）伴有视力、听力等障碍；（9）预计生存期≤3个月；（10）伴有神志不清或精神障碍患儿；（11）成熟B细胞型ALL。100例患儿中男60例，女40例；年龄1～12岁，平均年龄（5.81±0.46）岁；身高67～161 cm，平均身高（112.51±8.79）cm；体重6～56 kg，平均体重（31.06±3.51）kg。

3方法

3.1治疗方法：参照《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议（第四次修订）》中相关内容，全部患儿在确诊后均接受VDLP（B-ALL）或VDLD（T-ALL）治疗方案，VDLP方案内容包括长春新碱[静脉注射，1.5 mg/（m2·d），d8，d15，d22，d29]、柔红霉素[静脉滴注，30 mg/（m2·d），LR：d8，d15，IR和HR：d8，d15，d22，d29]、培门冬酶，肌注，2 500 IU/（m2·d），d9、d23共2次；泼尼松，口服，60 mg/（m2·d），d1～d28]治疗。VDLD方案包括长春新碱[静脉注射，1.5 mg/（m2·d），d8，d15，d22，d29]、柔红霉素[静脉滴注，30 mg/（m2·d），LR：d8，d15，IR和HR：d8，d15，d22，d29]、培门冬酶，肌注，2 500 IU/（m2·d），d9、d23共2次；泼尼松，口服，60 mg/（m2·d），d1～d7和地塞米松6 mg/（m2·d），d8～d28，口服，d29起用药量每2天减半，1周内减停]治疗。低度、中度和高度危险：鞘注甲氨蝶呤d1，三联鞘注d15，d33。

3.2ALL患儿的危险度分层判定及分组方法：参照《国家临床路径》[9]中相关内容，将全部患儿分为标危组、中危组和高危组。判定标准：标危组必须同时满足以下所有条件：（1）年龄≥1岁且＜10岁；（2）白细胞计数（white blood cell，WBC）＜50×109/L；（3）非急性T淋巴细胞白血病；（4）非成熟B细胞型ALL；（5）无t（9；22）或BCR/ABL融合基因；无t（4；11）或MLL/AF4融合基因；无t（1；19）或E2A/PBX1融合基因；（6）治疗第15天骨髓呈M1（原幼淋细胞＜5%）或M2（原幼淋细胞5%～25%），第33天骨髓完全缓解。中危必须同时满足以下4个条件：（1）无t（9；22）或BCR/ABL融合基因；（2）中枢白血病或和睾丸白血病；（3）标危诱导缓解治疗第15天骨髓呈M3（原幼淋细胞＞25%）或中危诱导缓解治疗第15天骨髓呈M1/M2；（4）如有条件进行微小残留病检测，则第33天危险残留病＜10-2。同时至少符合以下条件之一：（1）WBC≥50×109/L；（2）年龄≥10岁；（3）急性T淋巴细胞白血病；（4）t（1；19）或E2A/PBX1融合基因阳性；（5）年龄＜1岁且无MLL基因重排。高危必须满足下列条件之一：（1）t（9；22）或BCR/ABL融合基因阳性；（2）t（4；11）或MLL/AF4融合基因阳性；（3）中危诱导缓解治疗第15天骨髓呈M3；（4）第33天骨髓形态学未缓解（＞5%），呈M2/M3；（5）如有条件进行微小残留病检测，则第33天危险残留病≥10-2，或第12周危险残留病≥10-3。

3.3基线资料调查方法：由研究人员设计一般资料调查问卷，询问患儿家属，记录相关内容：（1）性别；（2）年龄；（3）身高、体重（可从病案室调取患儿身高、体重）。

3.4实验室指标检测方法：全部患儿均于初诊当天采集静脉血8 mL，分为4支试管。（1）血常规：取1支试管标本，使用日本希森美康XS-800i血细胞分析仪测定血红蛋白（hemoglobin，Hb）、WBC、红细胞计数（red blood cell count，RBC）及血小板（blood platelet，PLT）。（2）IL-10：取1支试管标本，经离心机进行离心处理（离心速度3 000 r/min，离心10 min，离心半径15 cm），离心后取血清待检。使用上海酶联的试剂盒，采用酶联免疫吸附试验法测定IL-10水平。（3）TK1：取1支试管标本，经离心机进行离心处理（3 500 r/min，5 min，15 cm），离心后取血清待检。使用海西唐生物科技有限公司的试剂盒，采用酶联免疫吸附试验法测定TK1水平。（4）凝血功能：取1支试管样本，经离心机进行离心处理（3 000 r/min，10 min，15 cm），离心完毕后取血浆待检。使用深圳市美思康的US-2200血液分析仪测定活化部分凝血酶原时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）、凝血酶时间（thrombin time，TT）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）水平。

4统计学方法 采用SPSS24.0软件进行数据处理，全部计量资料均经Shapiro-Wilk正态性检验，符合正态分布的资料以表示，组间用独立样本t检验，多组间用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；计数资料用百分比表示，采用χ2检验；若期望值＜5，则采用连续校正卡方检验；血清IL-10、TK1表达与ALL患儿危险度分层之间的相关性采用Kendall's tau-b相关性检验；血清IL-10、TK1表达与ALL患儿危险度分层的关系采用Logistic回归分析检验；P＜0.05为差异具有统计学意义。

结果

1ALL患儿危险度分层情况 全部患儿均接受危险度分层评估，其中24例标危，50例中危，26例高危，占比分别为24.00%（24/100），50.00%（50/100），26.00%（26/100）。

23组基线资料对比 3组患儿基线资料对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 3组基线资料对比

33组患儿实验室指标检测 全部ALL患儿的平均IL-10、TK1表达分别为（9.81±2.94）pg/mL、（4.79±1.35）pmol/L；高危组的IL-10、TK1及WBC计数均高于标危组和中危组，且组间两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 3组患儿实验室指标对比（）

表2 3组患儿实验室指标对比（）

注：与标危组对比，aP＜0.05；与中危组对比，bP＜0.05。

4血清IL-10、TK1及WBC计数与ALL患儿危险度分层的相关性分析 采用Kendall's tau-b相关性分析结果显示，ALL患儿血清IL-10、TK1及WBC计数与危险度分层之间呈正相关（r＞0，P＜0.05）。见表3。

表3 血清IL-10、TK1及WBC计数与ALL患儿危险度分层的之间的相关性分析

5血清IL-10、TK1及WBC计数与ALL患儿危险度分层关系的多元Logistic回归分析 将血清IL-10、TK1及WBC计数作为自变量，将ALL患儿危险度分层作为因变量（1=标危，2=中危，3=高危），建立多元Logistic回归分析结果显示，血清IL-10、TK1及WBC计数与ALL患儿危险度分层有关（P＜0.05）。相关参数见表4。

表4 血清IL-10、TK1及WBC计数与ALL患儿危险度分层关系的多元Logistic回归分析结果

讨论

作为儿童群体中高发的恶性血液肿瘤，ALL约占全部白血病类型的70%，具有起病急骤、病程短及进展迅速等特点，存在发生感染、贫血、出血等风险[10]。目前，经过规范化的诊治，ALL患儿的长期无事件生存率已增长至70%～80%，但仍有少数部分患儿临床治疗效果不理想，发生难治、复发等，对患儿预后产生不良影响[11]。临床既往通常采用WBC计数、原始/幼稚细胞比例、遗传学等指标判断ALL患儿病情、预后等情况，已成为临床公认指标[12]。但为了更好地评估ALL患儿病情和预后，仍需积极寻找其他与ALL发生、发展密切相关的生物分子标志物，或可为后续治疗提供新的靶点。

研究指出，机体免疫功能在白血病的发生、发展过程中发挥关键性作用，免疫功能异常不仅是白血病发病的重要原因之一，也会造成白血病患者体内的细胞因子分泌失衡[13]。IL-10是由辅助性T淋巴细胞（T helper cells，Th）2合成、分泌的一种细胞因子，可抑制抗原已致敏的CD4+Th0细胞向Th1细胞分化，进而促使Th0细胞向Th2方向分化，减弱Th1细胞分泌细胞因子的能力，从而抑制机体免疫功能，在肿瘤等疾病的发生、发展中占据重要角色[14]。另有研究指出，白血病进展过程中因克隆性白血病细胞的增殖失控、分化障碍及凋亡受阻等多种作用机制，导致骨髓或其他造血组织中的白血病细胞大量增殖，影响机体正常造血功能，进而引发疾病相关症状[15]。B系或T系淋巴细胞大量增殖是ALL的显著特征，患儿WBC计数明显升高，且极易发生眼、中枢神经系统等髓外浸润，增加预后不良的风险[16]。而TK1是一种细胞周期依赖性标志物，主要存在于增殖细胞质中，有研究表明TK1与细胞的增殖密切相关，其能够敏感反映细胞增殖异常，动态评估细胞增殖发展趋势，可用于评估肿瘤增殖速度和分期，与肿瘤发生密切相关[17]。既往研究证明，细胞的增殖速度、DNA的合成与TK1水平变化呈正相关，TK1在细胞分裂的G1期浓度较低，在G1和S期交界处开始逐渐升高，直至S/G2期达到高峰[18]。因此，本研究试图通过测定有关免疫功能和细胞增殖的血清指标IL-10、TK1水平，研究二者与ALL患儿危险度分层的关系。本研究结果发现，高危组的IL-10、TK1水平均高于标危组和中危组，ALL患儿血清IL-10、TK1水平与危险度分层之间呈正相关，表明ALL患儿的血清IL-10、TK1水平存在异常变化，且血清IL-10、TK1水平与不同危险度分层的ALL患儿存在一定的关系。究其原因：当IL-10水平升高时，机体免疫功能受到抑制，免疫监控能力降低，极易促使白血病细胞发生免疫逃逸，与ALL的发生与发展密切相关[19]。并且，IL-10可抑制炎症反应，导致细胞毒性T淋巴细胞对免疫无应答，增加免疫功能缺陷的发生风险，促进ALL的发生与发展[20]。TK1与细胞增殖速度有关，当其水平增加时，则提示细胞增殖分裂旺盛，淋巴细胞具有更强的增殖能力和侵袭能力，ALL患儿的危险度分层越高[21]。最后，本研究多元Logistic回归分析结果显示，以高危为参照，血清IL-10、TK1表达降低时，ALL患儿危险度分层低的可能性分别为7.128倍、13.572倍，进一步证实，血清IL-10、TK1与ALL患儿危险度分层密切相关。未来或可将血清IL-10、TK1作为评估ALL病情与预后的潜在生物标志物，有较好的应用前景。但本研究也存在一定的局限性，如血清IL-10、TK1二者能否相互作用、相互影响，促进ALL的发生和发展，其中机制尚未完全明确，未来仍需开展更多的研究进一步探索、分析。

综上所述，血清IL-10、TK1在ALL患儿中存在异常表达，且与危险度分层具有相关性，联合传统WBC计数、原始/幼稚细胞比例等检测有助于更加准确评估ALL患儿的病情，同时也为了解ALL的发病机制和ALL的靶向治疗提供新的思路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突