毛细管离心术在胎母血型不一致的临床大量FMH综合征的诊断价值*

张源秦 徐璐 马怡然 杨融辉 郝一文 程大也 丛桂敏

胎母输血（fetomaternal hemorrhage，FMH）是指一定量的胎儿红细胞通过破损的胎盘和（或）绒毛膜间隙进入母体血液循环，可以发生在怀孕的各个阶段[1]。FMH综合征指的是出血量较大，引发一系列不同程度的胎儿贫血和母亲溶血性失血反应的一种临床症候群[2]。国内外尚无大量FMH的出血量普遍接受的诊断阈值，目前普遍认为胎儿出血量≥30 mL对孕产妇血型免疫（特别是RhD抗原的同种免疫）、胎儿及新生儿预后具有意义[3-4]。大量FMH的诊断主要依靠流式细胞术、酸洗脱实验和HbF测定等，由于对实验设备和专业技术人员的要求高且操作复杂，难以在临床常规开展[5-6]。我们前期通过在体外模拟实验发现毛细管离心术对胎母ABO血型不一致的大量FMH具有一定的诊断价值[7]。本研究通过选取临床疑似为大量FMH综合征的临床标本对上述指标进行验证，以评估毛细管离心术对胎母血型不一致的大量FMH综合征的辅助诊断价值、临床适用性。

资料与方法

1一般资料 选取2020年7月～2021年7月在中国医科大学附属第一医院和沈阳市妇婴医院产科分娩，临床有大量FMH综合征典型表现的孕产妇25例。本研究获得中国医科大学附属第一医院伦理委员会及相关合作部门的批准（伦理批号: AF-SOP-07-1.1-01），所有孕产妇常规实验均知情同意并签署相关知情同意书，充分了解检测目的和过程以及可能存在的风险。

2病例纳入标准与排除标准 纳入标准：1）孕妇出现不明原因死胎；2）孕妇主诉胎动减少或消失；3）胎心监护异常（出现正弦波、胎心基线变异减少、晚期减速）；4）B超提示胎儿生长受限、胎儿贫血、水肿和（或）肝脾肿大；5）血管彩超发现MCA-PSV≥1.5 MoM ；6）新生儿进行性贫血；7）孕妇门诊为O型（丈夫血型为A型、B型或AB型）或孕妇门诊血型为RhD阴性（丈夫血型为RhD阳性）且产后母亲与新生儿血型不一致；满足1和7或2、3、4和7的临床表现、超声高度怀疑胎母输血综合征。

排除标准：1）血液病（如遗传性血红蛋白病、镰状细胞性贫血和β-地中海贫血等）；2）恶性肿瘤病；3）有脑部或精神类疾病患者；4）近三个月有输血史的孕妇；5）拒绝抽血配合者，资料不全。

3方法 所有纳入研究的可疑大量FMH的孕产妇同时行流式细胞术和毛细管离心术两种方法加以相互印证。

3.1毛细管离心术

1）将孕产妇新鲜EDTA-K2抗凝血用生理盐水洗涤3次，最后1次用1 000 g离心9 min，尽可能去掉上清后混匀；

2）将洗涤后的RBC吸出后混匀，加入2根比积管，留出5 mm长度封口备用；

3）血液加入端用橡皮泥封死管底，挤出的血液用纱布吸走，放入带有编号的离心槽，注意平衡，拧紧内盖，关上离心机外盖12 000 r/min离心20 min；

4）在距红细胞柱顶（远心端）5 mm处切开微量红细胞比积管，此段红细胞主要为胎儿红细胞；在距红细胞柱底（近心端）5 mm处切开微量红细胞比积管，此段红细胞主要为母体新鲜红细胞。近心端、远心端切开的红细胞比积管用生理盐水洗涤3次后进行试管法ABO血型正定型鉴定。

5）采用试管法对分离的远心端红细胞及近心端红细胞进行ABO血型正定型检测，如果不一致，表明毛细管离心术实验阳性，提示此孕妇发生了大量FMH。近心端红细胞ABO血型鉴定结果为O型，远心端红细胞ABO血型鉴定结果与脐带血标本中的红细胞血型一致（A型或B型）时证明毛细管离心技术分离成功。

以上参考《AABB技术手册》和《输血技术操作规程（输血科部分）》[8-9]。

3.2胎儿血红蛋白HbF的流式检测

1）用O型育龄期非妊娠健康女性捐献者EDTAK2抗凝血2 mL加入容量占比为5%的脐带血作为质量控制标本（阳性对照和阴性对照）；

2）实验血标本和对照血标本（孕产妇新鲜EDTA-K2抗凝血）的RBC计数在血常规计数仪上测定，并用PH=7.4的PBS调节至终浓度为2.5×106/mL；

3）取2×107个RBC在室温下用pH=7.4的PBS新配置成0.05%戊二醛溶液固定10 min；

4）用PBS将细胞洗涤3次，并在室温下用0.1%TritonX-100的PBS渗透5 min；

5）用PBS将细胞再次清洗后，试验管和阳性对照管取（1～2）×105个细胞与10 μL抗HbF抗体混合；阴性对照管取（1～2）×105个细胞与10 μL PBS混合；

6）各管均补充加入70 μL 0.1%牛血清白蛋白（PBS-BSA），将细胞在黑暗中干燥15 min；

7）用PBS将细胞洗涤3次，然后重悬于0.5 mL的1%多聚甲醛中，并在8 h内上机检测；

8）在Flowjo上分析计算胎儿血红蛋白HbF占比；

以上参考文献[10-11]。

3.3胎儿出血量的计算：流式分析检测的胎儿出血量=孕妇血容量×胎儿HbF（%）[12-13]。

4指标观察与数据收集 通过查阅临床电子病历系统，记录孕产妇年龄、胎龄、孕产次、主要诊断、胎心监护和计数胎动情况；记录新生儿Apgar评分、主要诊断、治疗及预后。

5统计学分析 所有数据均采用SPSS26.0进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，计数资料以例数、百分比（n，%）表示；以流式细胞术结果为金标准计算毛细管离心术的灵敏度、特异度、阳性预测值、阳性似然比和符合率。

结果

1大量FMH综合征孕产妇一般情况 2020年7月～2021年7月于中国医科大学附属第一医院和沈阳市妇婴医院产科分娩的孕产妇共12 017名。临床表现疑似大量FMH综合征25例，其中流式确诊出血量≥30 mL的FMH综合征孕产妇有15例，大量FMH综合征的发病率为1.25‰；15例大量FMH综合征中11例用毛细管离心术分离并鉴定出远心端胎儿红细胞血型。上述15例大量FMH综合征的年龄范围27～45岁，平均年龄33.73±4.83岁；孕次1～7次，平均怀孕3.2±1.373次；孕周33+6～39+2，平均孕周38.01±1.48；均为经产妇，剖宫产。15例大量FMH综合征均出现不同程度的胎心监护异常，其中13例出现胎动减少，见表1。

2新生儿情况 在15例出血量≥30 mL的大量FMH综合征的孕产妇中，有14例足月儿，1例出生时发生宫内死产。体重范围为1 500～3 810 g，平均体重2 685±727 g。2例发生新生儿Rh溶血（母婴Rh血型不合；新生儿溶血三项实验中，抗体释放试验和直接抗球蛋白实验阳性），8例高胆红素血症（早产儿血清胆红素＞225 μmol/L，足月儿血清胆红素＞220.6 μmol/L，每日胆红素升高超过85 μmol/L）[14]，5例颅内出血，2例呼吸困难、窒息，13例经过了输血等治疗恢复良好后出院。新生儿死亡率13.35%（2/15），见表2。

表2 新生儿一般情况

3毛细管离心术在大量FMH综合征（FMH≥30mL）的诊断结果 在25例高度怀疑发生大量FMH综合征的孕妇中，胎儿出血量≥30 mL有15例，其中13例胎儿与母亲ABO血型不一致，2例胎儿与母亲RhD血型不一致，毛细管检测出近心端与远心端血型不一致的阳性有11例且与产后胎母血型一致，详见表3。

表3 毛细管离心术诊断结果

4毛细管离心术在大量FMH综合征（出血量≥30 mL）的诊断效能评价 在25例高度怀疑发生大量FMH综合征的孕妇中，胎儿出血量≥30 mL有15例。毛细管检测出近心端与远心端血型不一致的阳性有15例，其中胎儿出血量≥30 mL有11例，还有4例胎儿出血量＜30 mL也出现了毛细管近心端远心端不一致的结果。因此，毛细管离心术在大量FMH 综合征（出血量≥30 mL）敏感度、特异度、阳性预测值、阳性似然比、符合率，见表4。

表4 毛细管离心术对FMH综合征（出血量≥30 mL）诊断性效能评价

讨论

大量FMH综合征，如急性失血量超过胎儿血容量的50%，可导致胎儿发生低血容量休克和心衰、甚至死亡；慢性失血时可出现除胎盘外的胎儿水肿、胎儿宫内发育迟缓甚至胎死宫内。慢性FMH的胎儿即使存活，可能会出现新生儿贫血、足月小样儿。此外，胎母血型不一致的大量FMH是造成孕妇同种免疫及新生儿溶血病发生的重要机制之一[15]。大量FMH刺激母体产生大量IgG抗体可导致胎儿严重溶血、甚至新生儿溶血病和高胆红素血症的发生、中枢神经系统损害、呼吸窘迫、持续性肺动脉高压、失血性休克或死产等[16-20]。大量FMH发生时，母亲可因胎母血型不合而发生溶血，出现发热、寒战等溶血性输血反应。

在15例出血量≥30 mL的大量FMH综合征孕妇中，有2例妊娠糖尿病，2例妊娠贫血，1例完全性前置胎盘，2例抗筛阳性（存在抗D抗体）；有13例出现了胎动减少，2例出现了胎动频繁；15例均出现胎心监护异常，3例出现正弦曲线，4例无反应或反应差，5例出现减速，4例变异或变异差；14例新生儿均发生不同程度贫血，1例胎死宫内，1例重度贫血放弃治疗，新生儿死亡率为13.3%（2/15）；8例出生后高胆红素血症，2例Rh系统溶血，2例出现呼吸困难和窒息，3例出现颅内出血，1例凝血功能异常；13例新生儿出现了不同程度的贫血，经过少量多次的输血治疗后预后较好。综上可见，大量FMH综合征严重危害胎儿和新生儿的健康和生命安全。

本研究以流式细胞术为金标准，流式细胞术诊断出血量≥30 mL的胎母输血综合征有15例，同步进行毛细管离心术检测，其中有11例出现了近心端和远心端胎母血型不一致的阳性结果，还有4例胎儿出血量＜30 mL母亲体重较轻血容量小也出现了毛细管近心端远心端不一致的结果。毛细管离心术在临床病例的大量FMH（出血量≥30 mL）的敏感度为73.3%，特异度60%，阳性预测值73.3%，符合率60%等指标都高于我们前期模拟实验中两个大量FMH组对应指标数值[6]，说明毛细管离心术在临床大量FMH病例的筛查效能更高。分析原因可能为模拟实验中孕妇血容量较大，胎儿红细胞在母血中所占比容较低；临床病例的被检孕妇血容量比模拟实验的血容量普遍较低，胎儿红细胞在母血中所占比容较高，更容易被毛细管离心所分离。毛细管离心术灵敏度为73.3%，如果实验结果阴性，也不能排除FMH综合征，应予以密切监护，必要时进行流式分析等其他检测方法加以实验室诊断；如果实验结果阳性，基本能证实胎儿出血量比较大，应予以密切监护，指导产科医生尽早干预并进行下一步治疗。

本研究中有4例孕产妇发生大量FMH综合征且胎儿出血量≥30 mL，毛细管离心术并未出现阳性结果，分析原因可能是部分孕产妇发现时已经发生了严重的大量FMH综合征，检测时距离发生胎母输血的时间过长，胎儿红细胞被母亲体内免疫性抗体破坏清除，以至于未检测出胎儿红细胞。PENG[21]通过体外模拟大量FMH模型发现当携带父亲抗原的胎儿红细胞（最重要的是ABO系统血型抗原）可能与母体的血浆不相容，可能被母亲体内天然的抗体清除。KIM[17]也认为在O型母体携带A、B或AB型胎儿的体内，天然存在异型抗血清会加速母体循环中胎儿红细胞的清除，因此在夫妇ABO血型不相容的情况下，建议在高度怀疑FMH综合征时应立即进行试验。

随着我国“三胎”政策的放开，FMH、大量FMH综合征的发病率会显著增加，因此大量FMH的早期诊断和早期干预是改善妊娠结局、保障孕产妇、胎儿及新生儿身体健康的必要措施。虽然毛细管离心术不是诊断FMH综合征的金标准，但对在临床上出现可疑FMH综合征的临床表现的大量筛查对预防胎母同种免疫可能至关重要。如果不能及时识别及诊断FMH综合征，不及时进行干预及治疗，可能导致胎儿及新生儿不良结局。我们建议有高危FMH风险且夫妇血型不一致的孕产妇，若孕妇产前血型已知，排除ABO亚型和抗原减弱等情况下，在妊娠中晚期用毛细管分离发现母体ABO的异型血细胞抗原，毛细管离心术实验结果阳性，结合FMH综合征的临床表现，可以认为发生了大量FMH综合征，指导产科医生早期进行干预及进一步治疗（如终止妊娠或输血治疗或保胎治疗），避免了漏诊和误诊。毛细管离心术简便、快速、易操作、不需要复杂的试剂，无侵入性，1～2 h即可回报结果，特别是在一些偏远地区缺乏FMH确诊的金标准时，更有可行性和经济适应性。

胎母血型不合的FMH综合征包括ABO血型不合、Rh血型不合及其他稀有血型不合。本临床研究仅针对胎母ABO血型系统和RhD血型进行了毛细管离心术的分离及检测研究，对于夫妻ABO血型一致，但其他血型系统不一致的FMH没有进行检测及研究。后期我们将增加高危FMH的毛细管离心术的检测病例数，了解临床真实的FMH发病率，特别是有临床意义的大量FMH发病率；对毛细管离心术筛查阴性病例但高度怀疑的FMH病例增加其他血型系统的检测，提高检出率，并探讨研究毛细管离心术结合ABO血型及其他血型检测对FMH综合征的出血量检出阈值、筛查的灵敏度及特异性。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突