基于网络药理学探讨小柴胡汤增强鼻咽癌放疗敏感性的分子机制

裴路，仇雯丽，王佳佳，李红阁，杨凤莲，王俊利

(1.右江民族医学院附属医院生殖中心，广西百色 533000；2.右江民族医学院a.研究生学院，b.药学院，c.检验学院，广西百色 533000)

鼻咽癌(nasopharynx cancer,NPC)是一种起源于鼻咽黏膜内层的上皮癌[1]，在两广地区高发。鼻咽癌恶性程度高，75%～90% 的新发病例已为局部晚期，常伴有颈部淋巴结转移，鼻咽癌的一线治疗是放射治疗。虽然放疗可以提高局部控制率，延长患者5年生存率至82.1%～83.3%，但放疗后的复发与远处转移是临床治疗中面临的两大难题[2]。小柴胡汤(XCHD)出自《伤寒论》，是传统的和解少阳之方剂，由柴胡、黄芩、半夏、甘草、大枣、人参、生姜组成，其中柴胡为君，用量最大[3]。本研究借助网络药理学，深入挖掘小柴胡汤增强鼻咽癌放疗敏感性的潜在靶点和作用机制，为小柴胡汤的进一步研究提供方向，为临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 寻找NPC放疗抵抗差异性表达基因通过GEO数据库，搜索关键词“nasopharynx cancer radiotherapy”得到GSE48501数据集，该数据集通过鼻咽癌抗辐射亚克隆CNE2-IR细胞系按照实验方案进行5轮亚致死剂量照射(11 Gy)培养生产，以放疗敏感的亲代细胞系CNE2细胞系为对照并进行测序，下载该数据集通过R4.0.5对这些数据整理和注释并通过edgeR包用于标准化基因表达，筛选条件为：(| log2FC| >1 和调整后的P<0.05)，得到2731个差异表达基因，1551个上调表达基因，1180个下调表达基因，并通过“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”和“enrichplot”等R包进行基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析进行功能注释。

1.2 XCHD有效成分及靶标的寻找XCHD的有效成分从中药系统药理学(TCMSP)数据库下载(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，其中包含很多中药条目，药物疾病网络和药物靶点网络。可从TCMSP数据库中获得大量草药信息，包括成分、分子名称、分子量(MW)、药物相似性(DL)、人类口服生物利用度(OB)、半衰期(HL)、水分配系数(AlogP)、氢键供体和受体的数目(Hdon/Hacc)、Caco-2渗透性(Caco-2)。OB是口服药物最重要的药代动力学特性之一，评价药物向全身循环的传递效率。其值由课题组前期研发的OBioavail 1.1 模型计算得出[4]。OB表示一个单位口服用药剂量能够产生药效的百分数，是决定活性分子类药性的关键指标。DL用于评估化合物成为药的可能性，只有具有较高OB和DL的分子才可能具有良好的药理学活性。参考Drug Bank数据库中药物的DL均值为0.18，所以将口服生物利用度标准采用≥30%、DL≥0.18的成分视为有效成分。得到246个有效活性成分。

1.3 将药物有效基因与NPC差异表达基因交集得到交集基因通过TCMSP数据库筛选XCHD的有效成分后，将有效成分上传到PubChem(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)多功能Web服务器，用于基于分子3D相似性方法探索药理学和化学结构的关联。我们从ChemMapper数据库中搜索了XCHD中每种活性成分的预测目标，并根据3D结构相似性高于1.0和预测得分高于0的标准进行了筛选，找到了有效成分的二维结构。此外，Uniprot(https：//www.uniprot.org/uploadlists/)用于标准化预测的靶标，并以基因ID的形式表达它们。为了提高目标的可信度，使用STITCH数据库(http://stitch.embl.de/，这是用于检索预测化合物与目标蛋白之间相互作用的常用数据库)预测目标。最后，制作了维恩图，并将两个数据库的交集视为XCHD的最终基因靶标。其中XCHD包括7种中药成分，一共得到246种有效活性成分，其与NPC差异性表达基因进行交集得到38个交集基因。

1.4 化合物-靶标-疾病(CTD)网络构建使用Cytoscape(v.3.8.0)分别构建中药中具有活性成分的246个靶基因和药物-疾病相同的38个基因的靶标网络及化合物-靶标-疾病(CTD)网络，可以看到XCHD活性成分网络与分子靶向预测的靶标以及化合物-靶标-疾病(CTD)网络核心关系。网络分析器插件用于根据以下标准识别关键有效成分和关键候选目标：程度值超过网络中所有节点平均值的节点。程度值是节点在网络中具有的边数，它指示一个节点与多少个草药/成分/目标相关。如果节点的度数值较大，则认为该节点在网络中起着更重要的作用。

1.5 交集基因蛋白互作网络(PPI)的构建从STRING数据库获得疾病和目标PPI数据，对得分≥0.04的PPI数据进行了筛选，将结果导入Cytoscape 3.7.1构建小柴胡汤-target-鼻咽癌PPI网络。

1.6 将交集基因进行GO、KEGG富集分析使用R软件处理上述38个交集基因，分别利用clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2，pathview插件包(vision 3.6.2)进行GO与KEGG的可视化，P值过滤条件为：PvalueFilter<0.05，矫正后的P值过滤条件qvalueFilter<0.05。为了进一步阐明XCHD有效成分治疗NPC的作用机制，对选定的靶标注明了化学癌变-受体的激活、p53、凋亡等信号通路。

2 结 果

2.1 寻找NPC放疗抵抗差异性表达基因通过GEO数据库，搜索关键词“nasopharynx cancer radiotherapy”得到2731个差异表达基因，1551个上调表达基因，1180个下调表达基因。见图1。

2.2 XCHD有效成分及靶标的寻找XCHD的有效成分从TCMSP数据库下载(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，根据OB和DL对小柴胡汤中的活性成分进行筛选，分别得到柴胡活性成分17个、黄芩活性成分36个、半夏活性成分13个、甘草活性成分92个、人参活性成分22个、生姜活性成分5个、大枣活性成分29个。见表1。

表1 小柴胡汤中靶点数目排名前9位的潜在有效活性成分

2.3 将药物有效基因与NPC差异表达基因交集得到交集基因将药物有效基因与NPC差异表达基因交集得到38个交集基因。见图2。

2.4 化合物活性成分靶点网络的构建活性成分靶点网络包括138个节点,215条线。拓扑结果显示，“degree”值较高的成分是槲皮素(quercetin,MOLD00098)、山奈酚(kaempferol,MOL000422)、汉黄芩素(wogonin,MOL000173)、芒柄花黄素(formononetin,MOL000392)、异黄酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone，MOL003896)、豆甾醇(stigmasterol,MOL000449)、柚皮素(naringenin,MOL004328)、β-胡萝卜素(beta- carotene,MOL002773)、黄芩素(ba-icalein,MOL002714)等,小柴胡汤主要通过9个活性成分作用于PPARG、RXRA、ACHE、MAOB、CASP3、CYP3A4、BAX 7个靶标基因,这7个靶标基因可能影响增强鼻咽癌放疗敏感性。见图3。

2.5 靶点PPI的构建从STRING数据库获得疾病和目标PPI数据，对得分≥0.04的PPI数据进行了筛选，将结果导入Cytoscape 3.7.1构建小柴胡汤-target-鼻咽癌PPI网络。蛋白互作网络中“degree”值较高的靶点是PPARG、RXRA、ACHE、MAOB、CASP3、CYP3A4、BAX等,提示这些靶点可能是小柴胡汤增强放疗敏感性的关键作用靶点。见图4。

2.6 GO功能富集分析将上述得到的38个交集靶点通过R语言的Bioconductor生物信息软件包进行GO功能富集分析。GO功能富集分析主要包括生物过程(biological process,BP)、细胞组分(cellular component,CC)和分子功能(mo-peculiar function，MF)三部分。根据P值升序排列结果前10条显著富集的条目，生物过程BP主要涉及对药物反应、氧化应激、对有毒物质反应、RNA聚合酶调控、细胞黏附；细胞组分涉及细胞膜、膜筏、膜微域等方面；分子功能涉及药物结合、蛋白质结合、酶结合和酶活性等方面。见图5。

2.7 KEGG通路富集分析通过R语言软件的Bioconductor生物信息软件包进行KEGG通路富集分析后,富集比较明显的前20个通路，包括: 化学致癌作用中-受体的激活、丙型肝炎信号通路、P53信号、凋亡等信号通路。见图6。

3 讨 论

小柴胡汤具有免疫调节和抗肿瘤作用。本研究结合GEO数据挖掘和网络药理学，分析预测小柴胡汤增强鼻咽癌放疗敏感性的潜在药理机制。小柴胡汤含有多种活性成分，可影响多个靶点和作用途径。使用TCMSP数据库筛选出OB≥30%、DL≥0.18的小柴胡汤相关活性化合物，构建了活性化合物-靶基因网络。结果表明，靶点富集较多的前3位化合物是槲皮素、山奈酚、芒柄花黄素(FN)。

槲皮素是广泛存在于水果、蔬菜及中草药中的天然黄酮醇类化合物，可调节细胞内外AMPK途径、PI3K-AKT途径和mTOR等多个信号通路[5-6]，进而影响肿瘤细胞的生长。SU等研究表明，槲皮素可通过AMPK信号通路激活诱导膀胱癌细胞凋亡[7]，其诱导细胞凋亡的作用机制可能是通过下调Bcl-2蛋白的表达而实现。槲皮素可通过调节miR-16-5p和WEE1的表达增强NSCLC细胞的放射敏感性[8]；也可通过靶向Notch-1通路增强结肠癌细胞的放射敏感性[9]。山奈酚是一种安全且潜在的放射增敏剂，可通过抑制AKT/PI3K和ERK通路以及激活线粒体凋亡通路，在体外和体内增加了辐射对肿瘤细胞的杀伤作用[10]。FN是一种从红三叶草中提取的功能性植物雌激素[11]，越来越多的证据表明FN对某些恶性肿瘤具有有效的药理活性，包括乳腺癌、卵巢肿瘤和肝癌[12]，此外，另一项研究表明，FN抗NPC是通过直接参与抑制鼻咽癌细胞的增殖过程，其药理机制与诱导线粒体依赖性细胞凋亡有关，FN的抗增殖和侵袭性益处是通过抑制细胞ERK1/2通路和灭活NPC细胞中的细胞内Lamin A/C信号来实现的[13]。本研究中靶点富集较多的槲皮素、山奈酚、芒柄花黄素在抗肿瘤方面的作用研究较少，可能是有价值的研究方向。

PPI网络分析结果表明，NPC中有5个枢纽基因MAPK3、CAT、CASP3、PPARG和CCND1受小柴胡汤调节。MicroRNA-143靶向MAPK3调节人乳腺癌细胞的增殖和骨转移。CASP3的遗传变异可能会增加头颈部鳞状细胞癌的风险；CASP3是一种重要的凋亡成分，是细胞凋亡的关键分子，细胞凋亡的形态变化是一系列胱天蛋白酶活化并水解底物的结果，其异常功能或许在癌症发病机制中起关键作用[14]。在人类非小细胞肺癌细胞中，PPARγ的激活能够克服 NRF2 依赖性化学抗性，在基底样乳腺癌中，PPARG激活显著降低了MnSoD的表达并增加了化学敏感性[15]。到目前为止，PPARG的参与已在一些其他位于头部或颈部的鳞状细胞癌中进行了探索，lncRNA HCG18在NPC中高度表达，并与NPC患者的不良预后相关。HCG18通过调节miR-140/CCND1轴和Wnt/β-catenin与Hedgehog途径充当肿瘤启动子[16]。CCND1的过度表达是人类癌症的公认标志，通过催化SAGA亚基 USP22控制CCND1泛素化对于癌细胞通过G1的细胞周期进程十分重要。

在GO富集方面，我们推断小柴胡汤可能通过干扰对药物的反应、转录RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录、氧化应激、对有毒物质反应、细胞黏附。RNA聚合酶Ⅱ是一种RNAP酶，存在于真核细胞的细胞核中，与NPC细胞的生长有关。KEGG通路富集分析结果显示化学癌变-受体的激活、p53、凋亡和癌症中的通路相关。有相关文献报道，在神经母细胞瘤小鼠模型中，p53的缺失诱导体内放射抗性[17]，在黑色素瘤中，p53的恢复有利于体内放射敏感性[18]。 在NPC细胞和小鼠中，发现MDM2抑制剂可抑制MDM2并增强TP53的mRNA和蛋白质水平，并促进细胞凋亡和肿瘤生长[19]。鼻咽癌组织内存在TP53基因突变，其可通过调控Bcl-2和Bax的表达，阻滞细胞周期，诱导细胞衰老或凋亡[20]。因此，我们提出小柴胡汤对NPC的药理作用可能通过这些途径发生。本研究也存在不足，中药单体是多靶点、多通路综合作用的结果，由于数据库不完善以及计算机无法真实模拟体内环境，因此本研究着重于理论分析，后期仍需要更多体内和体外实验进行验证，但这为后续机制实验及临床用药提供理论依据。