四神丸对溃疡性结肠炎大鼠IL-6/STAT3信号通路及Th1/Th2免疫轴平衡的影响

王盈蕴，王燕，朱向东，李洁，梁永林*

（1.甘肃中医药大学，甘肃兰州 730000；2.宁夏医科大学，宁夏银川 750004）

0 引言

溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis，UC）是一种以结肠粘膜慢性特发性炎症为特征的炎症性肠病（inflammatoryboweldisease，IBD），病位起始端在直肠，并会延伸，末端可至结肠近端[1]。腹泻、腹痛、大便里急后重并出现黏液脓血便等是UC的典型表现[2]。现今，UC具体的发病机制尚不清楚，但已证实与免疫反应缺陷、肠道菌群改变、遗传易感性和环境因素等有关[3]。UC临床常用的治疗药物包括氨基水杨酸、硫唑嘌呤和皮质类固醇等[4,5]，但这些药物往往会导致不同的副作用，如出现肾毒性，在长期治疗期间降低了患者的生活质量[6,7]。在此背景下，中医药在UC治疗中的作用受到广泛关注。四神丸最早记载于《陈氏小儿痘疹方论》中，由补骨脂、吴茱萸、肉豆蔻、五味子，加生姜、大枣组成[8]。越来越多的循证医学证据表明[9]，四神丸治疗IBD疗效良好，204例IBD患者总有效率可达到75.98%。本实验旨在探讨在脾肾阳虚型UC大鼠模型中四神丸对白介素（IL）-6/信号传导与转录激活因子3（STAT3）信号通路及辅助性T细胞（Th）1/Th2免疫轴平衡的影响。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级SD大鼠120只，雌雄各半，平均体质量(200±20)g，购自甘肃中医药大学科研实验动物中心，动物合格证号与许可证号分别为SCXK（甘）2020-0001、SYXK（甘）2020-0009。大鼠饲养于甘肃中医药大学动物实验中心的SPF级屏障实验室中，温度为(23±2)℃，相对湿度(55±5)%，噪声＜50dB。

1.2 药品与试剂

四神丸饮片（补骨脂、吴茱萸、肉豆蔻、五味子、生姜、大枣生药量比例为4∶1∶2∶2∶2∶2）及番泻叶饮片均购自于兰州惠仁堂大药房，由甘肃中医药大学杨扶德教授鉴定为正品。美沙拉秦缓释颗粒（上海爱的发制药有限公司，规格0.5g/袋，批号200707，国药准字H20143164）。氢化可的松注射液（国药集团容生制药有限公司，规格2mL：10mg，批号2008202，国药准字H20023069）；二硝基苯磺酸盐（DNBS）（德国Sigma公司，批号STBH1899）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号G1080）；鼠IL-6 酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒，鼠IL-10 ELISA试剂盒（江苏菲亚公司，批号分别为2105R81，2105R84）；STAT3抗体，TGF-β抗体，PPARγ抗体（英国Abcam公司，批号分别为ab68153，ab215715，ab209350）；p-STAT3抗体（美国CST公司，批号9145S）；CD3抗体（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号E-ABF1228S）；CD4抗体，IFN-γ抗体，IL-4抗体（美国Biolegend公司，批号分别为201505，507809，511905）；反转录试剂盒，qPCR试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司，批号分别为：H1125080，H4104620）；兔SP试剂盒（中杉金桥公司，批号SP-9001)。

1.3 仪器

IX51型显微镜（日本Olympus公司）；RM2245型切片机（德国LEICA公司）；Arcadia H型包埋机（德国LEICA公司）；C1000荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；IMARKMini Protean酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

2 实验方法

2.1 造模与给药

将所有大鼠随机分为空白组，模型组，四神丸低、中、高剂量组及美沙拉秦组，每组10只。采用病证结合法[10]，将大鼠进行番泻叶灌胃（10mL/kg），配合氢化可的松皮下注射（15mg/kg），1次/d，连续21d。21天后，禁食不禁水24小时，腹腔注射2%戊巴比妥钠（0.2 mL/100g）进行麻醉。将DNBS/乙醇溶液（100 mg/kgDNBS+1mL/kg50%乙醇）快速注入至肛门内8cm的深度，再注入约0.4mL的空气，捏紧肛门，将大鼠倒立1min，防止药液流出。造模成功后，根据人和大鼠的体表面积换算给药剂量，四神丸低、中、高剂量组灌胃量分别为含生药量6、12、24 g/kg，美沙拉秦组为0.36g/kg，灌胃体积为1mL/100g[11]。空白组和模型组灌服等体积蒸馏水。各组灌胃1次/d，连续21d。

2.2 标本采集

末次给药后，用2%戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，取血后颈椎脱臼法处死大鼠。留取结肠组织，一部分结肠固定在4%的多聚甲醛中，用于HE染色和免疫组化检测；一部分结肠组织用生理盐水浸泡并立即用于流式细胞术检测；一部分组织置于冻存管中在-80℃冰箱放置，用于RT-PCR检测。

2.3 HE染色观察结肠组织病理学变化

将固定在4%多聚甲醛中的结肠组织取出，进行冲洗，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，染色，显微镜下拍照观察结肠组织变化。

2.4 流式细胞术检测大鼠结肠组织中Th1细胞及Th2细胞比例

将结肠组织磨碎，制备单细胞悬液，放入离心机中离心，加入PBS液重悬。选择适量CD3抗体和IFN-γ抗体（Th1细胞）及适量CD4和IL-4抗体（Th2细胞），加入免疫细胞活化试剂刺激细胞，加入细胞固定破膜液，染色，设置同型对照实验，新鲜标本尽快用流式细胞仪上机检测。

2.5 ELISA检测大鼠血清中IL-6、IL-10因子的含量

使用ELISA检测血清IL-6、IL-10水平，全部操作按照试剂盒说明完成。

2.6 免疫组化法检测STAT3、p-STAT3、TGF-β1、PPARγ蛋白表达

取结肠组织切片，常规脱蜡及水化后，PBS清洗，用柠檬酸钠热修复两次，加入3%的过氧化氢孵育，滴加第一抗体（1∶200），湿盒4℃冰箱过夜后，加入相应二抗，室温孵育，DAB显色，苏木素复染，返蓝，中性树脂封片。运用使用Pannoramicviewer及Quant center软件进行观察及分析。

2.7 RT-PCR法检测STAT3、TGF-β1、PPARγmRNA基因表达

取结肠组织匀浆后提取总RNA，并按照反转录试剂盒说明书进行后续操作，运用RTPCR仪进行检测，使用2-ΔΔCT方法计算RNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物名称及序列表

2.8 统计学方法

全部资料用SPSS23.0统计软件进行分析，计量资料以（±s）表示，若数据符合正态性和方差齐性，组间比较用单因素方差分析。方差齐时组间比较采用LSD检验方法，方差不齐时选用Tamhane'sT2检验方法。

3 结果

3.1 结肠组织病理学改变

空白组中结肠组织染色均匀，结构清晰可见，肠粘膜排列整齐，腺体分布均匀。与空白组比较，模型组结肠损伤严重，肠粘膜消失，腺体结构破坏，可见大量的炎性细胞。与模型组比较，四神丸组及美沙拉秦组结肠损伤程度、肠粘膜及腺体结构破坏程度呈剂量依赖性减轻，炎性细胞呈剂量依赖性减少，其中高剂量组和美沙拉秦组效果最好。见图1。

图1 各组大鼠结肠组织病理形态（×40，×100）

3.2 大鼠结肠组织中Th1细胞及Th2细胞的比例

流式细胞术检测结果显示：与空白组比较，模型组大鼠结肠组织中Th1细胞比例显著升高（P ＜0.01）；Th2细胞比例显著降低（P ＜0.01）。与模型组比较，各治疗组大鼠结肠组织中Th1细胞比例显著降低（P ＜0.05，P ＜0.0 1）；四神丸中、高剂量组及美沙拉秦组大鼠结肠组织中Th2细胞比例显著升高（P ＜0.01）。四神丸高剂量组与美沙拉秦组比较差异无统计学意义。见图2-1，2-2，表2。

表2 信息文四摘神丸对UC 大鼠结肠组织中Th1和Th2细胞比例变化的影响（ ±s，n=6）

表2 信息文四摘神丸对UC 大鼠结肠组织中Th1和Th2细胞比例变化的影响（ ±s，n=6）

注：与空白组比较：★P＜0.05，★★P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01；与美沙拉秦组比较：◆◆P＜0.01，K.空白组 M.模型组 D.四神丸低剂量组 Z.四神丸中剂量组 G.四神丸高剂量组 Y.美沙拉秦组

续型电子期刊期刊之一组别Th1（%）Th2（%）空白组1.08±0.363.46±0.18模型组8.24±0.17**0.96±0.19**四神丸低剂量组6.79±1.04**#◆◆1.12±0.15**◆◆四神丸中剂量组4.99±0.7**##◆◆1.97±0.15**##◆◆四神丸高剂量组2.91±0.63**##2.95±0.27*##美沙拉秦组2.13±0.34##3.07±0.34##· 中国学术期刊综合评价数据库统计源期刊据库收录期刊情况

图2 -2四神丸对UC大鼠结肠组织中Th2细胞的比例的影响

图2 -1四神丸对UC大鼠结肠组织中Th1细胞的比例的影响

3.3 大鼠血清中IL-6、IL-10含量的比较

与空白组比较，模型组大鼠血清中IL-6含量显著升高（P ＜0.01）；IL-10含量显著降低（P ＜0.01）。与模型组比较，各治疗组大鼠血清中IL-6含量显著降低（P ＜0.01），四神丸高剂量组及美沙拉秦组血清中IL-10含量显著增加（P ＜0.01），且呈剂量依赖性改变，其中以四神丸高剂量组及美沙拉秦组最为显著，两组比较差异无统计学意义。见表3。

表3 四神丸对UC 大鼠血清中IL-6、IL-10因子水平的影响（ ±s，n=6）

注：与空白组比较：★P＜0.05，★★P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01；与美沙拉秦组比较：◆◆P＜0.01

组别IL-6ng/LIL-10 ng/L空白组55.62±9.302233.01±40.71模型组219.12±13.85**24.81±13.9**四神丸低剂量组181.3±11.12**##◆◆30.87±45.04**◆◆四神丸中剂量组147.11±8.11**##◆◆46.93±75.51**◆◆四神丸高剂量组101.68±13.87**##121..95±28.89**##美沙拉秦组88.86±19.32**##134.67±43.25**##

3.4 结肠组织中STAT3、p-STAT3、TGF-β1、PPARγ蛋白表达的变化

与空白组比较，模型组大鼠结肠组织中S T A T 3、p-S T A T 3 蛋白表达显著升高（P ＜0.01）；TGF-β1、PPARγ蛋白表达显著降低（P ＜0.0 1）。与模型组比较，各治疗组STAT3、p-STAT3蛋白表达显著降低（P ＜0.0 1），四神丸组呈剂量依赖性降低；TGF-β1、PPARγ蛋白表达显著升高（P ＜0.05，P ＜0.01），四神丸组呈剂量依赖性升高。其中，以四神丸高剂量组与美沙拉秦组最为显著，两组中STAT3、TGF-β1、PPARγ蛋白表达无统计学意义。见图3，表4。

表4 各组大鼠结肠组织STAT3、p-STAT3、TGF-β1、PPARγ蛋白表达的影响（±s）

表4 各组大鼠结肠组织STAT3、p-STAT3、TGF-β1、PPARγ蛋白表达的影响（±s）

注：与空白组比较：★P＜0.05，★★P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01；与美沙拉秦组比较：◆◆P＜0.01

STAT3p-STAT3TGF-β1PPARγ空白组1.00±0.151.00±0.161.00±0.091.00±0.08模型组 5.87±0.48**10.95±0.90**0.17±0.02**0.13±0.02**四神丸低剂量组 4.69±0.03**##◆◆8.53±0.92**##◆◆0.28±0.02**#◆◆0.29±0.05**#◆◆四神丸中剂量组 3.40±0.42**##◆◆6.75±0.70**##◆◆0.36±0.02**##◆◆0.43±0.07**##◆◆四神丸高剂量组2.03±0.27**##4.62±0.57**##◆◆0.75±0.09**##0.64±0.07**##美沙拉秦组2.03±0.18**##2.70±0.48**##0.77±0.07**##0.69±0.06**##

图3 各组大鼠结肠组织中相关蛋白的表达情况（×200）

3.5 结肠组织中STAT3、TGF-β、PPARγ mRNA相对表达量的变化

与空白组比较，模型组大鼠结肠组织中S T A T 3m R N A 的表达量显著升高（P ＜0.01），TGF-β1、PPARγmRNA的表达量显著降低（P ＜0.0 1）。与模型组比较，各治疗组大鼠结肠组织中STAT3mRNA的表达量显著降低（P ＜0.05，P ＜0.01）；四神丸中、高剂量组和美沙拉秦组大鼠结肠组织中TGF-β1mRNA的表达量显著降低（P ＜0.05，P ＜0.01）；四神丸高剂量组和美沙拉秦组中PPARγmRNA的表达量显著升高（P ＜0.01）。四神丸高剂量组与美沙拉秦组之间的基因表达差异无统计学意义。见表5。

表5 四神丸对UC大鼠结肠组织中STAT3、TGF-β1、PPARγ基因表达的影响（±s，n=6）

表5 四神丸对UC大鼠结肠组织中STAT3、TGF-β1、PPARγ基因表达的影响（±s，n=6）

注：与空白组比较：★P＜0.05，★★P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01；与美沙拉秦组比较：◆P＜0.05，◆◆P＜0.01

组别STAT3TGF-β1PPARγ空白组1.00±0.001.00±0.001.00±0.00模型组1.99±0.07** 0.35±0.04**0.48±0.07**四神丸低剂量组1.83±0.11**#◆◆0.47±0.07**◆0.51±0.09**◆◆四神丸中剂量组1.59±0.08**##◆0.59±0.20*#◆0.57±0.03**◆四神丸高剂量组1.41±0.05**##0.76±0.14*#0.73±0.07**##美沙拉秦组1.37±0.03**##0.79±0.07*##0.76±0.02**##

4 讨论

CD4+T细胞作为免疫系统的关键组成部分，包括调节性T细胞（Treg）和辅助性T细胞（Th）亚群[12]。Th1/Th2免疫轴控制着炎症和免疫耐受之间的微妙平衡，是维持肠道免疫稳态的关键因素，在病理状态下，Th1/Th2免疫轴会向Th1方向倾斜从而导致炎症的发生，这与UC的发生发展息息相关[13,14]。Th1主要分泌干扰素γ（IFN-γ）等，促进细胞毒性T淋巴细胞的活化以及和局部炎症有关的细胞免疫[15]。而Th2主要分泌IL-4、IL-10和IL-13等，刺激B细胞增殖并产生免疫球蛋白，与体液免疫有关[16]。结合病理切片、流式细胞术及ELISA结果发现四神丸可以减轻结肠组织炎性细胞的浸润程度，对结肠黏膜组织有一定的修复作用，还可增加Th2细胞在CD4+T细胞中的比例，同时降低Th1细胞比例，纠正Th1/Th2免疫轴失衡。

UC发生发展的潜在病理机制为信号传导与转录激活因子3（STAT3）介导的免疫功能下降和炎症浸润，STAT3激活导致促炎细胞因子和抗炎细胞因子分泌失衡，进一步加速炎症的发展[17]。STAT3在维持肠粘膜屏障中起关键作用，是结肠炎发病机制的重要转录因子，IL-6可激活STAT3使其磷酸化从而参与到炎症反应中[18-19]。转化生长因子-β（TGF-β）是重要的抗炎细胞因子，影响肠上皮细胞的稳态，主要通过下调免疫反应来抑制炎症的发生[20]。TGF-β在UC患者中代偿性上调，发挥炎症抑制的作用，并有助于诱导免疫耐受[21]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是一种核受体，在维持肠道免疫平衡、抗炎等方面发挥重要作用，UC患者存在不同程度的PPARγ表达障碍[22]。有研究发现[23]，IL-6促进STAT-3活化，而STAT-3下游分子miR-155靶向作用的PPARγ表达降低。PPARγ在结肠中的表达仅次于在脂肪组织中表达，其作为一种重要的抗炎介质，激活后可以保护小鼠免于DSS诱导的结肠炎，相反PPARγ的表达被抑制会增加结肠炎的易感性[22,24]。研究发现[25,26]，PPARγ的激活可以改善炎症状态下受损的肠道屏障功能，有效促进肠道受损的组织修复。

本实验研究结果显示，经四神丸干预后，STAT3蛋白及mRNA相对表达量逐渐下降，p-STAT3蛋白表达量逐渐下降，TGF-β1和PPARγ蛋白及mRNA相对表达量逐渐增加，同时IL-6水平降低，STAT3蛋白可能通过IL-6/STAT3途径参与UC的发病。四神丸对治疗UC大鼠具有积极的作用，其上调了大鼠血清中炎性抑制因子IL-10水平及结肠组织TGF-β1、PPARγ的表达；下调了大鼠血清中炎症因子IL-6水平及结肠组织STAT3的表达；同时下调了Th1细胞占比，上调了Th2细胞占比。综上所述，四神丸对改善脾肾阳虚型UC大鼠模型结肠炎症程度有积极作用，其机制可能是通过抑制IL-6/STAT3信号通路及纠正Th1/Th2免疫轴失衡，进而降低肠道感染及炎症。