基于网络药理学的健脾清化方治疗2型糖尿病的作用机制研究

唐励静，申利贤，吴广，王梅，李荣

南华大学附属第二医院，南华大学衡阳医学院，临床药学科，湖南衡阳 421001

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）是一种多因素引起具有遗传易感性的内分泌代谢性疾病，主要特征为慢性高血糖。《中国心血管健康与疾病报告2020》[1]报道在2015—2017年，中国成年人糖尿病患病率为11.2%，其中大陆成人患糖尿病人数约为1.298亿。在中医学中，糖尿病有其专属的名称，被称为“消渴病”或糖络病等，并且中医药在治疗糖尿病、防治并发症中有独特的优势和作用，《中国2型糖尿病防治指南（2020年版）》进一步明确了中医药在糖尿病防治中的重要地位和作用[2]。本研究通过网络药理学进一步探讨健脾清化方中有效成分和2型糖尿病的作用靶点及通路，阐述其可能潜在的作用机制，为中医药治疗2型糖尿病提供理论基础与科学依据的支持。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 药物成分与靶点筛选方法

通过TCMSP数据库，网站搜索地址为http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php，检索健脾清化方中“山药”“葛根”“黄 芪”“党 参”“黄 芩”“黄 连”“黄 精”“鬼 箭 羽”的化学成分。以口服生物利用度OB≥30%和类药性DL≥0.18为阈值筛选出相应化合物的活性成分，利用TCMSP数据库中的选项Related Targets-对筛选到的活性成分有关的靶点进行预测分析。标准基因名称使用UniProt(http://www.uniprot.org)的数据库筛选有效化合物对应的作用靶点命名。

1.2 药材-化合物-靶点网络图的构建

健脾清化方中有效的化合物信息和作用靶点使用Cytoscape3.7.2软件处理，有效化合物和作用靶点的标示用“节点”表示，用“边”表示二者之间的作用关系。通过网络拓扑学进一步分析，以等级值（Degree）、亲中心度值（closeness centrality）、中介中心度（betweenness centrality）来显示“节点”程度的重 要 性，Betweenness和Degree centrality的 数 值 越大，证明在网络中该“节点”越重要，以degree≥2倍中位数为筛选条件选择关键靶点。

1.3 2型糖尿病的靶点信息筛选

使用GeneCard数据库和OMIM数据库，网站搜索地址分别为https://www.genecards.org/和https://www.omim.org/，以关键词“Type 2 diabetes mellitus”进行检索，取交集为2型糖尿病的靶点。

1.4 潜在作用靶点的获取

通过Venny2.1平台分别录入1.1中所得的有效成分靶点和2型糖尿病的相关靶点，绘制韦恩图，得到相互交集的靶点蛋白即为健脾清化方治疗2型糖尿病的潜在作用靶点。

1.5 PPI网络的构建

使用STRING网站地址为https://string-db.org/，将以上潜在作用靶点基因导入，在STRING网站中设 定 属 性 为“Homo sapiens”，meaning of network edges设为“confidence”“minimum required interaction score:”设 为“0.95”，display simplifications设 置 为“hide disconnected nodes in the network”“minimum required interaction score:”设为“0.95”，其余参数为系统默认，在此基础上建立PPI网络。用Cytoscape Version 3.7.2软件对PPI关系进行可视化处理，以便于获得PPI网络；按degree大小顺序筛选靶标基因。

1.6 GO及KEGG靶点通路富集分析

使用DAVID数据库，搜索网址为https://david.ncifcrf.gov/home.jsp，将靶基因导入，将输入得到的靶基因名称列表，所有靶基因名称按照官方名称（official gene symbol）进行校正，并限定物种为Homo Sapiens，通过以上数据库检索以及转化的操作，以P＜0.01进行GO生物学过程和KEGG信号通路富集分析，并用Origin软件和R语言将其结果绘制成柱状图与气泡图进行可视化。

2 结果

2.1 药物的活性化合物成分及筛选

通过TCMSP数据库检索健脾清化方共有563个化合物，其中党参134个、黄芪87个、山药71个、葛根18个、黄芩143个、黄连48个、黄精38个、鬼箭羽24个，经OB≥30%并且DL≥0.18为阈值筛选得到活性成分共有131个，其中党参21个、黄芪20个、山药16个、葛根4个、黄芩36个、黄连14、黄精12个以及鬼箭羽8个。删除16个重复化合物数据，共获取115个有活性成分。活性化合物基本信息见图1。

2.2 药材-化合物-靶点网络图的构建

TCMSP数据库显示的Related Targets进行预测，得到115个活性成分相关靶点，收集到257个未重复的化合物及其靶点。使用Cytoscape3.7.2软件将之前获取的有效化合物和作用靶点信息对其建立关于有效化合物-作用靶点网络，见图2。网络总共包括396个节点（8种药材节点、131个化合物节点和257个靶点节点）与2267条边，分别为党参、黄芪、山药、葛根、黄芩、黄连、黄精、鬼箭羽及其化合物，中央菱形图标代表靶标基因，其中形状△代表药材，○代表化合物，◇代表基因。其中作用靶点用各节点表示，各作用靶点之间的相互作用关系用每条边表示，边数的多少标志该节点对应的作用靶点程度的重要性。结果显示，Degree值最高的化合物是MOL000098-槲皮素。此外，Degree≥2倍中位数的靶点有MOL000358-β-谷甾醇、MOL000422-山奈酚、MOL000449-豆甾醇、MOL000392-刺芒柄花素、MOL002714-黄芩素和MOL000006-木犀草素，表明以上所述的化合物在整个网络中发挥非常重要的作用，可能是健脾清化方治疗2型糖尿病的核心化合物。

图2 药材-化合物-靶标网络图

2.3 健脾清化方治疗2型糖尿病潜在作用靶点

预测健脾清化方治疗2型糖尿病的靶点根据GeneCards数据库检索2型糖尿病的治疗靶点，按照Score≥50为阈值得到284个2型糖尿病的治疗靶点。运用Venny2.1.0平台将健脾清化方主要活性成分调控的靶点与2型糖尿病的治疗靶点取交集，得到67个健脾清化方治疗2型糖尿病的靶点，见图3。

2.4 PPI网络

用STRING平台对药物和疾病映射得到的67个交集基因进行PPI网络分析，在Cytoscape Version3.7.2软件中将PPI关系导入后进行可视化处理见图4。由图3可知，该网络共有67个节点和164条边，其中蛋白用节点表示，连接到1个节点的线条数用度值表示，因此网络中每个节点的重要性得到合理的评估。PPI网络图中平均局部聚类系数为0.41，平均节点度为4.9。在平均度值以上的靶蛋白有23个，其中，排名前十的靶点分别为肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）、血管内皮生长因子（vascular endothlial growth factor,VEGF）、AKT1、FOS、TP53、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）、表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）、MAPK14和MAPK1，这些靶点在PPI网络中有显著意义的联系作用。其中，TNF节点最多，可能是健脾清化方中治疗2型糖尿病最主要的潜在靶点。TNF-α，IL-6作为重要的炎症细胞因子，可能通过葡萄糖代谢及脂代谢等途径干扰胰岛素信号的传导，并在胰岛素抵抗方面发挥重用的作用。

图3 健脾清化方与2型糖尿病靶点韦恩图

2.5 GO及KEGG靶点通路富集分析

使用数据库DAVID进行相关的GO功能富集分析，其中得到321个GO条目（P＜0.01），其P值显著的前10条见图4。其中生物过程（biological process,BP）条目215个，靶标数量前5的分别是一氧化氮生物合成过程的正调控、药物反应、蛋白质磷酸化的正调控、脂多糖介导的信号通路、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控。细胞组成（cellular composition,CC）条目23个，靶标数量前5的分别是细胞外间隙、细胞外区、血小板α-膜粒膜蛋白、小窝、细胞质核周区、分子功能（molecular function,MF）条目34个，靶标数量前5的分别是酶结合、相同蛋白结合、细胞因子活性、蛋白结合，及转录因子结合。通过KEGG通路富集分析(P＜0.01)的通路有89条，其P值显著的前20条见图5，其主要涉及的信号通路有肿瘤通路、美洲锥虫病、乙型肝炎、癌症中的蛋白多糖、膀胱癌、胰腺癌、TNF信号通路、弓形虫病、利什曼病、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、FoxO信号通路等。

图4 健脾清化方治疗2型糖尿病相互作用（PPI）网络图

图5 化合物作用靶点的GO富集分析及KEGG通路富集分析

3 讨论

现在吴以岭[3]认为2型糖尿病之证多“起于中焦”，指出其治疗应“从脾论治”的思想；韩煦等[4]比较健脾清化方组与模型对照组的葡萄糖耐量和胰岛素耐量，发现健脾清化方可改善T2DM大鼠的肠道胰岛素抵抗，降低血糖。网络分析结果发现健脾清化方中有效活性成分中化合物中综合评分前7位化合物分别是槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、刺芒柄花素、黄芩素及木犀草素。研究表明这些化合物对T2DM具有保护作用[5-7]。PPI网络图显示健脾清化方中的有效成分可能是通过TNF、IL-6、VEGF、AKT1、FOS、TP53、EGFR等药物-疾病共有靶点网络起作用。炎症是胰岛素抵抗和2型糖尿病代谢紊乱的基础，促炎细胞因子包括TNF-α、IL-6等在多种组织中能影响血糖浓度。李俊燕等[8]发现健脾清化方可通过JAK-STAT、MAPK、VEGF信号通路中VEGF等基因的表达来调控糖尿病大鼠血液转录水平，降低糖化血红蛋白，改善血糖水平。邱艳等[9]通过采用高脂喂养联合腹腔注射小剂量链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）对Wistar大鼠进行造模，连续4周灌胃给药，观察各组大鼠的随机血糖水平，发现用健脾清化方处理后能够增加肝脏中的GSK3β磷酸化水平和降低GS的磷酸化水平，进一步促进肝脏糖原合成，使糖尿病大鼠的血糖降低。健脾清化方对2型糖尿病患者有较好的调控作用，其作用的物质基础可能涉及NO生物合成过程的正调控，药物反应，蛋白质磷酸化的正调控，脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）介导的信号通路等生物学调控过程，与肿瘤、美洲锥虫病、乙型肝炎等通路密切相关。目前研究表明，高血糖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、胰岛素样生长因子、多种脂肪细胞因子、氧化应激及慢性炎症在糖尿病诱发恶性肿瘤的过程中起重要作用[10-12]。

综上所述，本研究基于网络分析对健脾清化方中其中所含的化学成分、作用靶标及其关键药效成分进行分析，初步探索了健脾清化方用于治疗2型糖尿病的作用机制，但基于及中药成分的复杂性和网络药理学的局限性，还需要通过药效学评价等实验进一步深入研究，为中医药治疗2型糖尿病提供一定的理论基础与科学依据。