基于Hippo信号通路探讨鹿茸提取液对BMSCs成骨分化的影响

王重一 邓洋洋 高巳东 林浩楠

辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847

骨质疏松症(osteoporosis，OP) 是一种以骨密度降低、骨脆性增加、骨折风险增加为特征的全身代谢性骨骼疾病[1]。

鹿茸，血肉有情之品，具有温肾壮阳，补益精血等功效[2]，其主要成分甾体类化合物[3]与鹿茸多糖[4]具有治疗骨质疏松症的功效。Hippo信号通路作为近些年研究热点，已证实其与骨质疏松症之间存在多元关联。现代医学证明，成骨细胞数量减少或转化能力降低等生物学行为与OP的发生密切相关。本研究以Hippo信号通路为切入点，试探究鹿茸提取液诱导BMSCs向成骨细胞转化的分子机制，为临床防治OP以及骨代谢失常引起的其他慢性疾病提供有效的中医药治疗方案，并为其作用机制提供部分实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验对象

SD大鼠BMSCs(冻存代次P2)购自赛业(苏州)。

1.2 试剂与药品

试剂：大鼠骨髓间充质干细胞完全培养基和茜素红均购自赛业(苏州)；PBS、DMSO以及多聚甲醛固定液均选自Hyclone；PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR® Premix Ex TaqTMII (TliRNaseH Plus)，ROX plus均购买于Takara公司；MST1、YAP、RUNX2和β-actin一抗均购买于Cell Signaling。

药品：鹿茸提取液。将鹿茸冻干粉过筛(80目筛)，将过筛后的粉末放入DMEM中, 制成浓度为0.78 mg/mL的鹿茸提取液，再经过计算与配制，最终配制成1 μg/mL的低浓度鹿茸提取液。鹿茸提取液为辽宁中医药大学实验室自制。

1.3 实验仪器

CO2培养箱(美国 Thermo公司)；IX71 型倒置相差显微镜(Olympus, 日本)；Labofuge 400R 型台式离心机(Heraeus，德国)；InfiniteM200型多功能酶标仪(奥地利TECAN)；Stratagene Mx3000p 荧光定量PCR仪(Agilent Technologies 美国)；BCA蛋白定量试剂盒(碧云天，中国)；大鼠ALP ELISA试剂盒(AMEKO，中国)。

1.4 方法及检测指标

1.4.1BMSCs的分组与培养：将细胞分为3组，正常组(大鼠骨髓间充质干细胞基础培养基+10 mL/dL胎牛血清含100 U/mL青霉素链霉素)，诱导组(大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化基础培养基+10 mL/dL胎牛血清含100 U/mL青霉素链霉素、谷氨酰胺+20 μL地塞米松+10 mmol/L β-甘油磷酸钠)，鹿茸组(鹿茸提取液浓度为1 μg/mL)。

1.4.2ALP活性测定：采用ELISA法，分别检测成骨性诱导培养第 6、12天以及18天的ALP水平，标准曲线制备及样品测定方法按照说明说操作。在490 nm的波长处检测OD值，并通过标准曲线计算各孔的浓度。

1.4.3茜素红染色：将BMSCs放入12孔板，每组2个孔，培养18 d后观察其生长分布后，将各孔的培养基吸出，滴入茜素红染液后将12孔板放进CO2培养箱内静待30 min。随后取出用PBS浸泡清洗，待表面无残留水液后，镜下观察钙结节的形态及密度变化。

1.4.4qRT-PCR法检测MST1，YAP以及RUNX2 mRNA表达水平测定：提取细胞RNA，实时定量PCR检测MST1，YAP以及RUNX2 mRNA相对表达量。qRT-PCR所用引物序列见表1。

表1 RT-PCR 所用引物序列Table 1 Primer sequences for RT-PCR

1.4.5Westernblot法检测检测MST1，YAP以及RUNX2的蛋白表达：首先将冷冻后的血清标本解冻，再使用BCA蛋白定量试剂盒对样本蛋白定量，然后用30 μg蛋白进行电泳后转移到PVDF膜上，而后继续使用封闭液进行封闭处理。以上步骤完成后加入各一抗(稀释倍数1∶1 000)4 ℃过夜孵育，加入二抗(稀释倍数1∶1 000)室温下孵育1 h后，TBST漂洗膜3次后在膜上滴上发光液，在凝胶成像仪上显示条带，使用Image J软件分析。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 各组BMSCs ALP活性比较

与正常组相比，6、12和18 d诱导组的ALP活性和水平均显著上调(P<0.01)，随着细胞培养的时间增加，细胞裂解液中ALP水平逐渐上升，第18天达到最高值。相应的鹿茸组，6和12 d的鹿茸组ALP活性和水平变化不明显(P>0.05)，而第18天鹿茸组的ALP活性和水平显著上调(P<0.01)；与诱导组相比，6、12和18 d鹿茸组的BMSCs ALP活性和水平显著降低(P<0.01)，详见表2。

表2 各组6、12 d以及18 d的BMSCs ALP活性比较(μg/L,

2.2 各组钙结节情况

由图可见，BMSCs诱导18 d后，与正常组(A)相比，诱导组(B)和鹿茸组(C)的钙结节数目多且密集，而诱导组(B)与鹿茸组(C)相比，鹿茸组(C)的钙结节最多且密集成片，由此证明鹿茸提取液对于促进钙结节的形成效果更加明显。详见图1。

注：A：正常组；B：诱导组；C：鹿茸组。

2.3 qRT-PCR法检测结果。

与正常组相比，诱导组和鹿茸组YAP和RUNX2 mRNA的表达显著上调(P<0.01)，MST1 mRNA的表达均显著下降(P<0.01)；与诱导组相比，鹿茸组MST1 mRNA的表达显著上调(P<0.01)，而YAP和RUNX2 mRNA的表达显著下降(P<0.01)，但其活性较强。详见表3。

表3 各组细胞MST1、YAP和RUNX2 mRNA表达的比较

2.4 Western blot法检测结果

与正常组相比，诱导组的YAP和RUNX2蛋白表达水平显著上调(P<0.01)，而MST1蛋白表达水平则呈现显著下降(P<0.01)，相应的鹿茸组YAP蛋白表达水平显著上调(P<0.01)，RUNX2蛋白表达水平同样上调(P<0.05)，而MST1蛋白表达水平则呈现下降(P<0.05)；与诱导组相比，鹿茸组MST1蛋白表达水平显著上调(P<0.01)，而YAP和RUNX2蛋白表达水平显著下降(P<0.01)。详见图2、图3、表4。

表4 各组细胞MST1、YAP和RUNX2蛋白表达水平的比较

注：与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；与诱导组相比，##P<0.01。A：正常组；B：诱导组；C：鹿茸组。

图3 MST1、YAP和RUNX2的蛋白表达水平柱状图Fig.3 Protein expression histogram of MST1, YAP and RUNX2

3 讨论

3.1 “肾-精-髓-骨”与OP

有关于“肾-精-髓-骨”的理论最早出现在《黄帝内经》的诸多篇幅中，从中医上表述肾主骨的概念已传承千载，其内涵为肾精滋养且如润骨骼。而骨骼作为其“靶器官”与肾中之精存在密切联系，维系肾与骨之间的物质是骨髓，而骨髓由肾精所化生，骨骼的强健与否和肾中精气盛衰密切相关，因此众多实验与临床治疗多从“肾”与“骨”之间的关系入手。而由于年老体衰或妇女绝经等原因，肾虚所致精不足，精亏累及髓的化生不足，髓不养骨导致骨骼脆弱，正如《灵枢·本神》所记载：“精伤则骨酸痿厥”。由此可见，肾精滋养是人体的骨骼正常发育生长基本前提，也是维持骨骼强健的本元。当肾藏精功能失常，精不足则髓不化，导致骨失所养，会形成多种骨代谢疾病。

3.2 “BMSCs”与OP

近些年BMSCs作为研究的热点，其在防治OP方面功不可没。BMSCs主要存在于人体骨髓中，是一种多向分化潜能的成体干细胞，可经诱导而转化为成骨细胞，类似中医学中的“精”和“髓”。BMSCs具有增殖和多向分化能力，在本细胞实验中，BMSCs经鹿茸提取液诱导转化为成骨细胞并迅速大量增殖，证明BMSCs其分化为成骨细胞对促进骨形成有着重要的作用，其在防治OP或促进器官发育等生理功能方面占据重要的地位。

3.3 Hippo信号通路与“BMSCs”

成骨细胞的分化对于骨稳态是至关重要的，只有当骨形成和骨吸收维持在平衡状态的情况下才能保证骨稳态，当骨吸收大于骨形成时，骨稳态被打破，会诱发骨代谢疾病，所以维持骨稳态是保证骨重塑的关键。对于OP的治疗，应当是促进BMSCs的成骨分化为主，本研究中，qRT-PCR与Western biot实验结果显示，在与正常组对比后发现，诱导组的YAP和RUNX2 mRNA的表达显著上调(P<0.01)，也有研究[5]证明，Hippo信号通路可以促进对小鼠骨髓间充质干细胞分化增殖，在Hippo-YAP信号通路中，下游关键效应因子YAP活性的强弱会影响到BMSCs的增殖与分化。在敲除掉YAP后，BMSCs成骨分化受到限制[6]，表明下游关键效应因子YAP对于BMSCs的增殖分化起到至关重要的作用。

3.4 补肾填精中药与“BMSCs”成骨分化

作为补肾填精中药的代表之一鹿茸，其在治疗OP备受专家和学者的青睐，唐中尧等[7]通过数据检索，发现在临床上治疗OP的常用中药中，鹿茸的出现频率为48.4 %。鹿茸中含有蛋白多肽、多糖等多种成分，而鹿茸多肽的比重更多，其成分占据一半以上[8]。鹿茸多肽由赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸等组成[9]，具有广泛的药理作用，在防治PMOP方面发挥至关重要的作用。研究[10]证明，鹿茸多肽可明显提高去卵巢大鼠骨组织中成骨细胞标志RUNX2水平，并上调其基因表达，提高骨组织中RUNX2的蛋白表达，与其对照组相比，显著提高了去卵巢大鼠的骨密度。而在本研究中，通过鹿茸提取液诱导后，BMSCs 的ALP水平及活性均有所提升，而ALP则是成骨细胞的一种早期特征性生物标志物[11]，且第18天鹿茸组的ALP活性和水平显著上调，ALP可进一步促进成骨细胞矿化，茜素红实验结果显示，鹿茸组钙结节最多且密集成片，由此证明鹿茸提取液对于促进钙结节的形成效果更加明显。在qRT-PCR和Western blot实验结果中，鹿茸组的MST1、YAP和RUNX2的mRNA表达与蛋白表达水平同样表现出不同程度的上调，这也佐证了鹿茸在促进BMSCs的成骨分化和防治OP方面发挥了积极地作用，同时鹿茸在促进BMSCs向成骨细胞分转化以防治骨质疏松症的同时还具有安全且不良反应小的优势。

综上，围绕中医“肾主骨”及其相关的理论知识，结合现代科学研究前沿，通过补肾填精中药鹿茸促进BMSCs的增殖分化为成骨细胞防治OP具有良好研究的前景，深入探索相关机制可为Hippo信号通路的临床研究提供新的研究方向，为骨质疏松症的研究带来潜在治疗靶点，为临床技术的推广带来新思路。