石柱单枝连“形、色、味、量”等级评价研究

冉继春，秦伟瀚，谭春斌，阳 勇，张小梅，樵星芳，吉光见稚代

重庆市中药研究院，重庆 400065

黄连为毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.、三角叶黄连CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao或云连CoptisteetaWall.的干燥根茎[1]。自古以来即认为四川为黄连主产地，《名医别录》记载：“黄连生巫阳及蜀郡大山”[2]。其中，石柱黄连最为著名，在黄连行业一直具有很高的地位[3]。有研究发现石柱不同栽培片区黄连不同部位主要生物碱含量均存在差异，且4种生物碱的含量高低顺序均为：小檗碱>黄连碱>表小檗碱>巴马汀[4]。目前，中药材鉴别主要是以人工评价为主，缺乏客观性量化指标，重复性差，个体差异大，传承困难[5]，电子舌、色度仪已广泛应用于中药领域[6-9]。黄连在《中国药典》中除长度、直径有明确的数字规定外，对颜色、味道均没有可量化的具体标准。黄连在市场上流通中主要是按外观大小来定价，且外观等级标准也日趋完善[10,11]。在经验鉴别中黄连一直以“味苦、色黄”者为佳，为规范黄连市场流通方式，填补黄连在颜色、味道数字化评价方面的空白；该研究以电子舌技术表征“味苦”，电子眼表征“色黄”，挖掘黄连“色、味”的数字化信息特征，并划分石柱黄连的“形、色、味、量”的数字化等级。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与材料

TS-5000Z电子舌(日本，INSENT公司)；传感器详细信息见表1。SA124S-CW分析天平(德国，artorius公司)；LC-20A 型高效液相色谱仪(日本，岛津公司)；色谱柱Welch Ultimate®XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；KQ-500DB超声波清洗机(中国，昆山市超声仪器公司)；CM-5分光测色计(日本，KONICA MINOLTA)；TG-16K离心机(中国，四川蜀科仪器有限公司)；UPR-11-20L优普纯水机(中国，四川优普超纯科技公司)。对照品盐酸小檗碱(批号110713-202015，中国食品药品检定研究院，纯度：85.9%)；乙腈(色谱级，德国Merck公司)，其余试剂均为分析纯；水为一级水。购买市售三个等级黄连样品，产地均为重庆市石柱县，经本院吉光见稚代研究员鉴定均为毛茛科植物黄连的干燥根茎。样品信息详见表2。

表1 TS-5000Z电子舌传感器检测范围

表2 石柱黄连药材来源

1.2 方法

1.2.1 药材前处理方法

取石柱单枝连置于烘箱55 ℃干燥8 h，至含水量<8%，打粉，过3号药典筛，密封保存待用。

1.2.2 电子舌检测方法

测试液制备：参比唾液：30 mmol/L氯化钾+0.3 mmol/L酒石酸；负极清洗液：100 mmol/L盐酸+30%乙醇；正极清洗液：10 mmol/L氢氧化钾+100 mmol/L氯化钾+30%乙醇。

供试品制备：取黄连粉末约0.1 g，精密称定，加入10 mmol/L氯化钾100 mL，搅拌溶解，超声(40 kHz)提取10 min，过滤，所得滤液即为待测液。

1.2.3 颜色检测方法

取黄连粉末约0.2 g，精密称定，加一级水50 mL溶解，超声(40 kHz)提取30 min，高速离心(8 000 r/min)10 min，取上清液1 mL加一级水稀释至10 mL。采用分光测色计，液体测量，测定提取液的L*、a*、b*值；运用程序软件Spectra Magic Ver 2.50，测定前用一级水对仪器进行空白校准，观察光源为D65透过光，观察视角10°，起止波长：360～740 nm，每个样品测定5次后取平均值。

1.2.4 生物碱测定方法

色谱条件：流动相为乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(50∶50)(每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g,再以磷酸调节pH值为4.0)，流速为0.6 mL/min，检测波长为345 nm，柱温为35 ℃，进样量为10 μL。

对照品溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱对照品适量加甲醇溶解，配制为90.5 μg/mL的溶液。

供试品溶液的制备：取黄连粉末约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(100∶1)的混合溶液50 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，离心，取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，精密量取续滤液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀、过滤，即得。盐酸小檗碱和黄连药材的HPLC图见图1。

图1 盐酸小檗碱(A)和黄连药材(B)的HPLC图

1.2.5 外观测定

称取石柱单枝连药材约50 g，计算单个重量值；每批药材随机抽取30个单枝连，用游标卡尺测定其长度、直径，即得外观性状值。

1.3 数据处理

利用SPSS软件进行Pearson双变量相关性分析和k平均值聚类分析；采用SIMCA软件进行PLS-DA偏最小二乘法判别分析。

2 结果与分析

2.1 石柱单枝连味道、颜色、生物碱与外观检测结果分析

黄连水提取液在AN0、BT0两个传感器的响应值大，且均在无味点以上，从检测结果可知药材味觉中的苦味值很大，其中药物苦味最大，盐酸盐类苦味次之。AE1、C00传感器响应值均在无味点以下，说明黄连的酸性苦味和涩味传感器响应值比基准液更小，但是黄连溶液对C00、AE1感应器刺激有响应值，可以一定程度反映黄连在这两个感应器的味觉值，其响应值为负数，感应器刺激越大，响应值的绝对值越大(见表3)。采用国际照明委员会(CIE)颜色系统[12]，黄连颜色检测结果显示(见表3)，L*、b*两个色度方向均为正值；而a*值为负值，表示黄连水提取液颜色为黄绿色，且颜色鲜明。石柱黄连内生物碱中盐酸小檗碱含量最高(见表4)，三个等级石柱黄连的味道、颜色、生物碱含量和外观性状有所差异，其中，外观性状中的长度值差异最大，三个等级药材在外观值上呈递减分布，而味道、颜色、生物碱含量呈均匀分布。药材仅仅按照外观大小来划分等级来定价、流通并不能满足现实药材的实际需求，将药材按味道、颜色、生物碱含量、外观值重新划分等级，给黄连市场流通提供新的参考。

表3 石柱单枝连味道与颜色检测结果

表4 石柱单枝连外观性状及生物碱检测结果

2.2 石柱单枝连味道、颜色、生物碱、外观的相关性分析

采用SPSS 22.0对石柱单枝连味道、颜色、生物碱含量、外观性状数据进行相关性分析，由表5的相关性结果可知，石柱单枝连的外观值与味道值呈显著相关性。其中重量、直径与酸性苦味、酸性苦味回味呈显著正相关，而直径与这两个味觉值相关性更为显著；重量、长度、直径与涩味回味值均呈显著负相关，说明石柱单枝连外观性状值越大涩味回味值越小；重量、直径值越大，酸性苦味、酸性苦味回味味觉感应越强。石柱单枝连生物碱含量与味道、颜色之间存在显著相关性。巴马汀、表小檗碱含量与药物苦味呈显著负相关；盐酸小檗碱含量与涩味、涩味回味呈显著正相关。说明巴马汀、表小檗碱含量越高药物苦味越淡；盐酸小檗碱含量越高，涩味、涩味回味越浓。a*与巴马汀含量呈显著负相关；b*与盐酸小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱含量均呈显著正相关。说明黄连水提取液颜色越黄，生物碱含量越高，颜色越绿，巴马汀含量越少。各味觉值之间也具有显著相关性，酸性苦味回味与涩味回味呈显著负相关；与酸性苦味显著正相关，涩味回味与酸性苦味显著负相关，与涩味显著正相关，盐酸盐类苦味与涩味显著正相关。石柱单枝连亮度值L*与长度值呈显著负相关，而颜色与味道并无显著相关性。各相关系数及显著水平详见表5。

表5 石柱单枝连各指标相关性分析

2.3 石柱单枝连聚类分析

采用SPSS 22.0分析软件，将23批单枝连的外观值、颜色值、味道值、生物碱含量值作为聚类指标，进行k-中心聚类分析，在参考其他标准[10,11]，以及市场需求和该批药材外观等级的基础上，将本批样品分为三类，其中26%为一类(6个)，39%为二类(9个)，35%为三类(8个)，最终聚类结果见(见表6)。三个类别聚类组成员信息详见表7，距离表示每个样品与各自聚类中心的距离。

表6 石柱单枝连最终聚类分析

表7 石柱单枝连聚类成员信息

2.4 石柱单枝连“形、色、味、量”等级划分

将聚类结果采用SIMCA 14.1统计软件中PLS-DA模型分析，结果显示，该模型能对聚类结果进行区分，实现药材分类鉴别，且解释度较好。经统计分析得到分散点图和变量重要性因子分布图(见图2、图3)，以及12个投影重要性(VIP值)大于0.5的变量，其中长度、b*值和药物苦味这3个变量的VIP值大于1，长度的VIP值高达2.759，b*值的VIP值为1.374 3，药物苦味VIP值为1.22。VIP值大于0.5的变量取决于样品的数量集，所以在样品数量增加时这些变量影响程度也随之增大。本次样本中VIP值大于0.5的9个变量投影重要性的变量，按从小到大顺序依次为：0.5

图2 石柱单枝连PLS-DA分析

图3 石柱单枝连PLS-DA的VIP变量投影

根据SPSS 22.0中k均值聚类分析法得到最终聚类中心值(见表6)。黄连的主要颜色表达值为黄色方向的b*值，主要味道值为药物苦味和盐酸盐类苦味，主要外观值为长度和直径，主要生物碱含量为盐酸小檗碱，考虑到标准的可执行性，所以去掉颜色值L*和a*；味道值酸性苦味回味和酸性苦味；外观值的重量值；生物碱中巴马汀的含量，这6个指标的等级划分。将石柱单枝连在PLS-DA模型分析中余下6个VIP值大于0.5指标值划分为三个等级，各指标等级划分详见(见表8)。

表8 石柱单枝连等级划分

一等级：单支，质坚，表面无毛须，无杂质。按外观或味道或颜色或含量计，允许12%石柱单枝连不符合一等级要求，但应符合二等级要求，或在二等级容许度范围之内。

二等级：单支，质坚，表面无毛须，少量杂质。按外观或味道或颜色或含量计，允许12%石柱单枝连不符合二等级要求，但应符合三等级要求，或在三等级容许度范围之内。

三等级：单支，质坚，表面无毛须，少量杂质。按外观或味道或颜色或含量计，允许12%石柱单枝连不符合三等级要求。

3 结论

目前中药材品质仍以化学成分作为主要评价标准，中药成分复杂，导致药效作用也是内在物质相互作用下的整体过程，因此，中药材整体性品质评价尤为重要，“色、味”代表了药材内有共同属性的物质，对药材具有是整体性评价意义。为了完善黄连药材的鉴别与规格等级评价体系，以达到药材品质整体性评价，本研究利用现代化仿生技术，将黄连在传统鉴别中标志性特征“色黄、味极苦”用数字化方式表达，同时划分颜色、味道数字化等级，实现中药材感官描述数字化，传承优良历史经验，为中药材数字化等级划分标准、实现整体性感官鉴别数字化奠定基础。