盐黄柏指纹图谱研究及质量标志物预测分析

刘晓琳，吴文平，潘礼业，邢菊玲，官永河，杨晓东，庞 伟，李国卫

广东一方制药有限公司 广东省中药配方颗粒企业重点实验室，佛山 528244

黄柏为芸香科植物黄皮树PhelllodendronchinenseSchneid.的干燥树皮，习称“川黄柏”。剥取树皮后，除去粗皮，晒干。黄柏味苦性寒，具有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮之功用；盐黄柏为黄柏照盐水炙法炒干的炮制品，可滋阴降火，用于阴虚火旺，盗汗骨蒸[1]。黄柏的主要化学成分包括生物碱类、柠檬苦素类、酚酸类及黄酮类[2]。研究发现，黄柏不同炮制品中化学成分及其含量、药理作用有变化及差异，盐黄柏对金黄色葡萄球菌及白喉杆菌的抑制作用均优于黄柏丝[3-5]，此外，盐黄柏代谢抑制功能优于黄柏，该活性被认为是黄柏滋阴作用的物质基础，故经盐炮制后黄柏的滋阴作用加强[6]。2020版《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)采用HPLC法测定盐黄柏中小檗碱及黄柏碱的含量，并规定其含量分别不少于3.0%及0.34%，本研究以盐黄柏为研究对象，建立了22批盐黄柏HPLC指纹图谱，在主成分分析(principal component analysis，PCA)的基础上运用正交偏最小二乘分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)初步筛选出不同批次盐黄柏的差异性成分，结合指纹图谱数据分析及网络药理学分析方法，从化学、生物信息及数理统计相结合的角度筛选盐黄柏的活性成分，进而确认盐黄柏质量标志物，为盐黄柏质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪(沃特世公司，Waters e2695，2489 UV/Vis Detector);Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)色谱柱;万分之一天平(梅特勒-托利多公司，ME204E);百万分之一天平(梅特勒-托利多公司，XP26);数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，KQ-500DE)；超纯水系统(默克股份有限公司，Milli-Q Direct)。

1.2 试剂和试药

3-O-阿魏酰奎宁酸(四川省维克奇生物科技有限公司，纯度：98.4%，批号：wkq20022003)；5-O-阿魏酰奎宁酸(四川省维克奇生物科技有限公司，纯度：HPLC≥ 98%，批号：wkq19100907)；盐酸小檗碱(中国食品药品检定研究院，含量：86.8%，批号：110713-201613)；盐酸黄柏碱(中国食品药品检定研究院，含量：94.9%，批号：111895-201504)；甲醇(西陇科技股份有限公司)；乙腈(默克公司，色谱级)；研究所用盐黄柏饮片Salt-fried Phellodendri Chinensis Cortex(SPCC)来源信息见表1，经广东一方制药有限公司技术中心/质量中心主任中药师魏梅鉴定为芸香科植物黄皮树PhelllodendronchinenseSchneid.的干燥树皮的炮制加工品。

表1 盐黄柏饮片来源信息

2 方法与结果

2.1 盐黄柏指纹图谱研究

2.1.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)色谱柱；流动相为乙腈(A)-0.4mol/L NH4Cl(B)，梯度洗脱：0～5 min，95% B；5～40 min，95%→75% B；40～45 min，75%→65% B；45～50 min，65%→45% B；50～60 min，45%→10% B；体积流量为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为10μL；检测波长为210 nm。

2.1.2 对照品溶液制备

取3-O-阿魏酰奎宁酸对照品、5-O-阿魏酰奎宁酸对照品、盐酸黄柏碱对照品、盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL分别含3-O-阿魏酰奎宁酸对照品35 μg、5-O-阿魏酰奎宁酸对照品75 μg、盐酸黄柏碱150 μg、盐酸小檗碱100 μg的混合溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液制备

取盐黄柏饮片粉末(过四号筛)0.1 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

方法学考察

2.1.4.1 专属性考察

精密吸取50%甲醇(阴性对照)各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1。实验结果表明该分析方法能准确检测所指认的特征峰，不受提取溶剂的干扰。

图1 阴性对照色谱图

2.1.4.2 精密度考察

取同一供试品溶液，精密吸取10 μL，按照“2.1.1”项下色谱条件，重复进样6次，记录色谱图，以与小檗碱参照物相应的峰为S峰，计算特征峰相对保留时间和相对峰面积。结果显示各共有峰的相对保留时间与相对峰面积RSD < 3%，表明仪器精密度良好。

2.1.4.3 稳定性考察

取同一供试品溶液，精密吸取10 μL，按照“2.1.1”项下色谱条件，分别在0、4、8、16、20、24 h进样，记录色谱图，以小檗碱峰为S峰，计算特征峰相对保留时间和相对峰面积。结果显示各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD < 3%，表明供试溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.4.4 重复性考察

取同一批盐黄柏饮片粉末0.1 g，共6份，精密称定，按照“2.1.3”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件，进样，记录色谱图，以小檗碱峰为S峰，计算特征峰相对保留时间和相对峰面积。结果显示各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD < 3%，该方法的重复性良好。

2.1.5 特征峰指认及共有峰确认

采用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.0版)对22批盐黄柏饮片指纹图谱(见图2)进行分析，按平均数法生成对照图谱(见图3)，建立各自指纹图谱并生成指纹图谱共有模式，共确定9个共有峰。

图2 盐黄柏指纹图谱叠加图

图3 盐黄柏对照图谱

按“2.1.1”项下的色谱条件分别对供试品溶液和对照品溶液进行测定，通过与对照品保留时间进行比对，确定4个化学成分，分别为3-O-阿魏酰奎宁酸(峰2)、5-O-阿魏酰奎宁酸(峰3)、黄柏碱(峰6)、小檗碱(峰9)(见图4)。《中国药典》2020年版[1]将黄柏碱、小檗碱作为评价黄柏质量的指标性成分，其中小檗碱含量较高且出峰位置适宜，色谱峰较稳定，故最终选择小檗碱作为参照峰S。

图4 盐黄柏及对照品HPLC图

2.1.6 相似度评价

采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.0版)对22批盐黄柏饮片指纹图谱进行叠加，进行相似度评价(见表2)。结果显示，不同批次盐黄柏饮片样品的相似度均大于0.95，表明样品指纹图谱与对照图谱的相似度较高，因此，该图谱可作为盐黄柏饮片的指纹图谱。

表2 盐黄柏指纹图谱相似度

2.1.7 不同批次盐黄柏差异性成分研究

2.1.7.1 主成分分析

将共有峰各色谱峰峰面积(见表3)相对于称样量量化，通过SPSS 20.0软件对22批盐黄柏饮片特征图谱峰面积结果进行主成分分析。由表4、表5可知，前3个成分累积方差贡献率为93.699%，基本可以反映盐黄柏饮片样品信息。特征图谱主成分1贡献率为61.811%，其中峰6(黄柏碱)、峰3(5-O-阿魏酰奎宁酸)在主成分1中贡献率较大，峰2(3-O-阿魏酰奎宁酸)、峰4在主成分2中贡献率较大，峰8在主成分3中贡献率最大，因此可以认为峰2(3-O-阿魏酰奎宁酸)、峰3、峰4、峰6(黄柏碱)、和峰8是影响盐黄柏饮片质量的重要因素。根据各主成分得分进行综合评价(见图5)，对22批盐黄柏饮片质量进行排序，四川省得分均高于其他省份，说明四川省作为黄柏的道地产区具有独特优势。

图5 综合得分图

表3 22批盐黄柏指纹图谱共有峰峰面积

表4 各主成分的特征值及方差贡献率

表5 主成分分析结果

2.1.7.2 正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)

为寻找盐黄柏饮片产生差异性的主要标记物，在主成分分析的基础上，进一步采用SIMCA 14.1 软件OPLS-DA分析上述两组的差异性成分，归一化方法选择Par，默认自动建模(Autofit)，所得结果显示R2X= 0.732，R2Y= 0.727，预测能力参数Q2为0.597，均大于0.5，说明预测结果良好。采用正交偏最小二乘法分析得到各特征峰的VIP值(见图6)。结果显示，峰6(黄柏碱)、峰9(小檗碱)VIP值均≥ 1.25，表明影响显著，说明共有峰峰6(黄柏碱)、峰9(小檗碱)是A、B两组的差异性成分，由于四川省为黄柏的道地产区，质量最佳，且四川省各批次的峰6(黄柏碱)和峰9(小檗碱)峰面积相对于称样量量化后均较其他省份高，因此可以认为峰6(黄柏碱)、峰9(小檗碱)可作为盐黄柏饮片的质量控制的标志物。

采用置换检验(Permutation test)验证OPLS-DA模型的可靠性，并设置置换次数为200。结果见图7，A、B两组回归线在Y轴截距均< 0，表明模型未出现过拟合，OPLS-DA模型可靠。

2.2 网络药理学研究

2.2.1 候选化合物靶点预测

通过中药系统药理数据库(TCMSP，https://tcmsp-e.com/)、PubChem Compound数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Therapeutic Target Database数据库(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)、Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)、Pharm mapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)检索3-O-阿魏酰奎宁酸、5-O-阿魏酰奎宁酸、小檗碱及黄柏碱等化合物，筛选化合物作用的靶点；并通过Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)将预测出的靶点蛋白转换为对应的基因名。将各数据库筛选出的靶点蛋白合并，除去重复靶点，最终得到与4个化合物相关的198个靶点蛋白。

2.2.2 靶点蛋白与蛋白互作(PPI)网络分析

将获得的198个靶点导入在线STRING软件(https://cn.string-db.org/)，物种为人(homo sapiens)，设置最高置信度蛋白交互参数评分值> 0.9，隐藏网络中断开的节点，获得PPI网络图(见图8，degree值越大，节点越大)。利用Cytoscape软件采用MCC计算方法对PPI进行拓扑分析，按得分值排名筛选出前15个关键靶点，分析结果见表6，这些靶点主要与小檗碱、黄柏碱、3-O-阿魏酰奎宁酸及5-O-阿魏酰奎宁酸有关。

图8 PPI网络图

表6 关键靶点汇总

2.2.3 功能富集分析与通路分析

GO功能富集分析：利用Metascape数据库(https://metascape.org/)对上述198个作用靶点进行GO功能富集分析，选择P值< 0.01。结果得到生物过程(biological process，BP)条目419个，主要涉及的生物过程有：细胞对氮化合物的反应、循环系统、蛋白质磷酸化、对外来刺激的反应、MAPK级联的正向调节等。细胞组成(cellular components，CC)条目有67个，主要富集在突触前膜、受体、膜筏、磷脂酰肌醇3-激酶复合物、神经元、胞质核周区等区域。分子功能(molecular function，MF)条目有125个，主要富集在神经递质受体的活动、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、儿茶酚胺结合、配体门控离子通道活性等功能。P值排名前20条目的BP、CC、MF见图9。

图9 GO功能富集分析柱状图

KEGG富集分析设置P值< 0.01，富集得到的主要涉及5-羟色胺能突触途径、钙信号通路、刺激神经组织中的交互、癌症通路、炎症介质对TRP通道的调节等，由此可知，盐黄柏是通过多靶点、多通路发挥协同作用的。按照P值从小到大的顺序筛选前20条，绘制气泡图(见图10)。

图10 KEGG通路富集分析气泡图

2.2.4 “成分-靶点-通路”网络构建

将4种化学成分和分析得到的15个靶点以及KEGG通路富集分析得到的前20条通路导入Cytoscape软件中构建“活性成分-靶点-通路”网络，并进行可视化分析，如图11。根据分析结果，以化合物-靶点-信号通路的连接度(degree)为参考，发现小檗碱及黄柏碱有较高的连接度，提示小檗碱(degree = 10)及黄柏碱(degree = 3)化合物可能是盐黄柏的高活性成分；PRKCA(degree = 10)、MAPK14(degree = 6)、ADRB(degree = 5)、AR(degree = 4)、ROCK1(degree = 4)、ROCK2(degree = 4)、RAC1(degree = 4)、JUN(degree = 4)的连接度高于其他7个靶点，表明活性成分可能是通过PRKCA、MAPK14等多个靶点发挥作用。癌症通路(pathways in cancer，degree = 12)、cAMP信号通路(cAMP signaling pathway，degree = 5)、cGMP-PKG信号通路(cGMP-PKG signaling pathway，degree = 3)、TRP通道对炎症介质的调控(Inflammatory mediator regulation of TRP channels，degree = 3)4条通路的连接度高于其他通路，说明该4条通路可能是盐黄柏潜在Q-maker的重要信号通路。

图11 活性成分-靶点-通路网络

3 讨论与结论

黄柏的化学成分主要包括生物碱类、黄酮类、甾醇类化合物及挥发油等，其中生物碱类化合物是黄柏的主要有效化学成分。经研究发现，黄柏经盐制后，其主要有效成分小檗碱及黄柏碱的含量都有所上升，经盐炮制后有利于其生物碱成分的溶出[7]。本研究通过建立指纹图谱指认了小檗碱、黄柏碱、3-O-阿魏酰奎宁酸及5-O-阿魏酰奎宁酸4个化学成分。经网络药理学分析，发现小檗碱及黄柏碱化合物可能是盐黄柏的有效活性成分，并筛出潜在的8个核心靶点(PRKCA(degree = 10)、MAPK14(degree = 6)、ADRB(degree = 5)、AR(degree = 4)、ROCK1(degree = 4)、ROCK2(degree = 4)、RAC1(degree = 4)、JUN(degree = 4))，这些靶点可能作用于癌症通路(Pathways in cancer)、及cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)、cGMP-PKG信号通路(cGMP-PKG signaling pathway)及TRP通道在炎性介质的调控(Inflammatory mediator regulation of TRP channels)中发挥重要作用，这与盐黄柏的药效滋阴降火可能具有一定相关性。因此，初步预测小檗碱、黄柏碱为盐黄柏潜在的质量标志物成分。现代研究结果表明小檗碱具有抑菌、抗炎等药理活性，可通过降低磷化ERK/JNK蛋白表达水平而产生抗炎作用，可通过抑制非小细胞肺癌中COP9信号转导体5(CSN5)的脱泛素活性，减少细胞程序性死亡配体1(PD-L1)的表达，促进抗肿瘤免疫[8,9]，此外，小檗碱还具有降糖、降压、增强肠管张力和振幅以及对前列腺的渗透作用[10,11]。黄柏碱可抑制ROS引起的炎症通路上相关蛋白的表达，抑制IKK/NF-κB通路，还可显著降低NF-κB的下游蛋白COX-2的表达，在体内外均有着较好的抗氧化及减轻炎症损伤的作用[12,13]。奎宁酸衍生物在抗感染、抗心血管疾病及降糖等方面具显著的活性[14]。阿魏酰奎宁酸类化合物是一种有效的酚类抗氧剂，其抗氧化能力要强于咖啡酸、对羟苯甲酸、阿魏酸、丁香酸等，且具有消除体内自由基、抑制突变和抗肿瘤作用等[15]。

中药化学成分复杂多样，中药质量是中药临床安全有效的基础，通过高效液相色谱检测出中药含有的所有化学成分，然后采用网络药理学的方法，能快速得到其含有的活性化合物，高效研究其中的活性成分，排除与主治无关或毒性成分，研究各组分对多靶点的活性，从而有效的节省时间和成本，提高中药活性成分筛选的效率[16]。为明确盐黄柏的质量标志物，本研究采用HPLC法对22批不同产地的盐黄柏进行研究，建立了盐黄柏的指纹图谱，确认了9个共有峰，不同批次盐黄柏指纹图谱的相似度评价结果发现，相似度在0.958～0.999，表明22批盐黄柏饮片化学成分相似度高，质量较为稳定均一。通过主成分分析结果可知，四川省饮片主成分综合排名较其他省份高，说明四川省作为黄柏传统道地产区的科学性；OPLS-DA分析发现小檗碱和黄柏碱是不同盐黄柏饮片的重要差异性成分，再结合网络药理学可知小檗碱、黄柏碱是盐黄柏发挥功效的主要活性成分。由此，可以确认小檗碱、黄柏碱是盐黄柏潜在的质量标志物。

本研究采用HPLC结合化学计量法与网络药理学研究从有效性角度预测出小檗碱、黄柏碱为盐黄柏的活性成分和质量标志物，为盐黄柏的质量控制提供参考。