不同蒸馏时间香薷挥发油主要成分含量及抑菌活性研究

陈海鹰1 左小明1 朱珊梅1 左晶2

1.江苏省常州市第三人民医院药事科,江苏 常州 213000；2.江苏省常州市第三人民医院急诊科,江苏 常州 213000

香薷为唇形科植物石香薷MoslachinensisMaxim.或江香薷M.chinensis‘Jiangxiangru’的干燥地上部分，具有发汗解表，化湿和中的功效[1]。挥发油是香薷的主要药效部位，具有广谱的抗菌作用[2-3]，可作为抗菌防疫产品的原料。李艳秋等[4]将香薷挥发油制成了纳米乳喷雾剂，具有良好的抗菌作用。

水蒸气蒸馏法是提取挥发油最常用的方法，蒸馏时间是影响挥发油成分、含量和药理作用的重要因素，邹月等[5]发现不同蒸馏时间艳山姜、芳樟叶中挥发油的得率、化学成分及含量具有差异性，何金明等[6]发现不同蒸馏时段的迷迭香精油的抗氧化能力具有较大的影响。香薷挥发油的提取率与蒸馏时间的动力学关系已有学者研究[7]，然而不同蒸馏时间香薷挥发油化学成分和药理作用有无差异尚无文献报道。因此，本研究对不同蒸馏时间香薷挥发油主要成分麝香草酚和香荆芥酚的含量和不同蒸馏时间制得的香薷挥发油的抑菌活性进行了研究，以期为以抑菌活性为导向的香薷挥发油提取工艺的研究提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂 香薷饮片(产地：湖南邵阳；批号：200817)，购自安徽亳州市永刚饮片厂有限公司，经常州市第三人民医院范正达主任中药师鉴定为唇形科香薷(江香薷M.chinensis‘Jiangxiangru’)的干燥地上部分。无水硫酸钠、无水乙醇分析纯，购自国药化学试剂有限公司。MH琼脂培养基(批号：201109)、MH肉汤培养基(批号：181116)，购自北京三药科技开发公司。麝香草酚(含量为99.9%，批号100508-201603)、香荆芥酚(质量分数99.6%，批号111691-201704)购自中国食品药品检定研究院。大肠埃希菌(Escherichiacoli)[ATCC25922]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[ATCC29213]、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[ATCC27853]，由常州市第三人民医院检验科细菌室提供。

1.2 仪器 挥发油测定器(上海建强玻璃仪器有限公司)、ZNHW控温电热套(上海锦赋实验仪器设备有限公司)、SW-CJ-1A水平层流净化工作台(吴江市净化设备总厂)、GSP-9080MBE隔水式恒温培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、RE-52CS旋转蒸发仪(上海雅荣生化设备仪器有限公司)、电子比浊仪DensiCHEK Plus(生物梅里埃美国股份有限公司)、XP105电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)、Agilent7890B气相色谱仪(美国安捷伦科技公司)。

2 方法与结果

2.1 不同蒸馏时间香薷挥发油的提取 精密称取香薷饮片5份，每份 100 g，精密称定，按照《中国药典》2020年版四部“挥发油测定方法”提取挥发油，分别保持微沸 1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 后停止蒸馏，收集油水混合物，用正己烷萃取挥发油3次，每次 5 mL，合并萃取液，加入适量无水硫酸钠脱水，2～8 ℃ 静置 24 h 后过滤，减压除去正己烷，精密称定挥发油的重量，计算香薷挥发油提取率，实验重复3次。香薷挥发油提取率(%)= 香薷挥发油重量(g)/香薷药材重量(g)×100%。

2.2 GC法测定香薷挥发油中麝香草酚与香荆芥酚的含量

2.2.1 色谱条件 PEG-INNOWAX弹性石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.32 μm)；载气为高纯氮气(纯度≥99.999%)，分流进样，分流比 10∶1，进样口 250 ℃，进样量 1 μL。程序升温：初始柱温 70 ℃，保持1 min，以 20 ℃·min-1升至 210 ℃，保持 10 min，再以 20 ℃·min-1升至250 ℃，保持3 min。FID检测器温度250 ℃，空气流量 400 mL·min-1，氢气流量40 mL·min-1，尾吹气流量25 mL·min-1，色谱柱流量1 mL·min-1。

2.2.2 溶液的配制 精密称取麝香草酚对照品50.35 mg，香荆芥酚12.27 mg，置于5 mL容量瓶中，加入无水乙醇使溶解，定容至刻度，摇匀，配成麝香草酚浓度为10.07 mg·mL-1、香荆芥酚浓度为2.454 mg·mL-1的混合对照品储备液。取混合对照品储备液，用无水乙醇稀释，制得麝香草酚和香荆芥酚浓度分别为125.9 μg·mL-1、30.67 μg·mL-1的混合对照品溶液。精密称取香薷挥发油9.84 mg，置于25 mL容量瓶中，加入无水乙醇使溶解，定容至刻度，摇匀，得供试品溶液。

2.2.3 专属性 取“2.2.2”项下混合对照品溶液和供试品溶液及空白溶剂无水乙醇，分别按上述色谱条件进样分析。结果表明，供试品色谱图中，在与对照品色谱图相同保留时间处有色谱峰，且与相邻色谱峰之间分离较好，溶剂无水乙醇对其无干扰。理论塔板数按麝香草酚和香荆芥酚计均大于10000，麝香草酚和香荆芥酚分离度大于1.5。如图1所示。

a.供试品溶液；b.对照品溶液；c.空白溶液；1.麝香草酚；2.香荆芥酚图1 气相色谱图

2.2.4 线性与范围考察 取“2.2.2”项下混合对照品储备液用无水乙醇稀释，制成麝香草酚浓度分别为503.5 μg·mL-1、251.5 μg·mL-1、125.7 μg·mL-1、62.87 μg·mL-1、31.44 μg·mL-1，香荆芥酚浓度分别为122.7 μg·mL-1、61.35 μg·mL-1、30.67 μg·mL-1、15.34 μg·mL-1、7.669 μg·mL-1的系列混合对照品溶液。取对照品储备液和稀释后的各浓度对照品溶液 1 μL，按照“2.2.1”色谱条件进样，记录麝香草酚和香荆芥酚的保留时间和峰面积，以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归。结果麝香草酚的回归方程为Y=1.559X+0.763，相关系数r=0.9999，线性范围为31.44～1007 μg·mL-1；香荆芥酚的回归方程为Y=1.539X+0.545，相关系数r=0.9999，线性范围为7.669～245.4 μg·mL-1。

2.2.5 精密度考察 取“2.2.2”中混合对照品溶液，按上述的色谱条件，连续进样6次，记录麝香草酚和香荆芥酚的保留时间、峰面积。结果麝香草酚峰面积RSD为0.989%，香荆芥酚峰面积RSD为1.056%，说明该仪器的精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取同一份香薷挥发油平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进样，记录麝香草酚和香荆芥酚的保留时间、峰面积，结合称样量计算供试品中麝香草酚和香荆芥酚的含量。结果6份供试品中麝香草酚含量的RSD为0.716%， 6份供试品中香荆芥酚含量的RSD为0.717%，说明该方法的重复性较好。

2.2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，按上述色谱条件，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h 进样，记录麝香草酚和香荆芥酚的保留时间、峰面积。结果麝香草酚峰面积的RSD为0.903%，香荆芥酚峰面积的RSD为0.914%，说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取香薷挥发油(麝香草酚含量为63.69%，香荆芥酚含量为13.67%)约7 mg，置于25 mL容量瓶中，加入混合对照品溶液(麝香草酚和香荆芥酚浓度分别为4.379 mg·mL-1、0.988 mg·mL-1)1 mL，加入无水乙醇使溶解，定容至刻度，摇匀，平行制备6份，按上述色谱条件记录麝香草酚和香荆芥酚的保留时间、峰面积，计算回收率。结果见表1，结果表明麝香草酚和香荆芥酚的加样回收率符合实验要求。

2.3 统计学方法 采用SPSS 22.0对数据进行方差分析，多组间两两比较采用LSD检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2.4 不同蒸馏时间香薷挥发油中麝香草酚与香荆芥酚的含量 精密称取不同蒸馏时间的香薷挥发油10 mg，置25 mL容量瓶中，加入无水乙醇使溶解，定容至刻度，摇匀，平行制备3份，按上述色谱条件记录麝香草酚和香荆芥酚的保留时间、峰面积，计算不同供试品中麝香草酚和香荆芥酚的含量，结果见表2。由表2可看出，随着蒸馏时间的延长，香薷挥发油的提取率不断上升，各蒸馏时间香薷挥发油的提取率具有显著性差异(P<0.05)。然而，各蒸馏时间所得香薷挥发油中麝香草酚含量无显著性差异；蒸馏时间为2 h、3 h、4 h、5 h的香薷挥发油中香荆芥酚含量无显著性差异，但高于蒸馏时间1 h的香薷挥发油(P<0.05)。

表2 不同蒸馏时间香薷挥发油中麝香草酚和香荆芥酚含量

蒸馏时间/h挥发油提取率/%麝香草酚含量/%香荆芥酚含量/%10.5728±0.0161.87±0.0612.53±0.1320.7505±0.02∗62.67±0.8913.26±0.20∗30.8890±0.01∗63.15±0.6013.34±0.13∗40.9595±0.01∗63.24±1.0013.52±0.14∗50.9634±0.01∗63.38±0.9213.25±0.20∗F630.81.59615.80P<0.0010.250<0.001

2.5 不同蒸馏时间香薷挥发油的抑菌活性

2.5.1 K-B纸片法测定不同蒸馏时间香薷挥发油的抑菌圈直径 用0.5麦氏比浊标准的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌悬液制备含不同菌株的MH平板，将无菌的空白药敏纸片贴于平板表面，分别滴加5 μL不同蒸馏时间的香薷挥发油，33 ℃倒置培养24 h，十字交叉法测定抑菌圈直径。每组实验重复 3 次，取平均值，结果如图2和表3所示。由结果看出，不同蒸馏时间所得香薷挥发油对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌圈直径均无显著性差异，相同蒸馏时间的香薷挥发油对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径明显大于对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径(P<0.05)，相同蒸馏时间的香薷挥发油对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径无显著性差异。

A.铜绿假单胞菌；B.大肠埃希菌；C.金黄色葡萄球菌图2 不同蒸馏时间香薷挥发油的抑菌作用图

表3 不同蒸馏时间香薷挥发油的抑菌圈直径

蒸馏时间/h 抑菌圈直径/cm 大肠埃希菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌FP129.98±0.37∗30.73±0.55∗8.30±0.1918610.000230.10±0.43∗31.09±0.68∗8.33±0.20898.90.000330.12±0.23∗30.90±0.57∗8.31±0.1536590.000

表3(续)

2.5.2 肉汤稀释法测定不同蒸馏时间香薷挥发油的最小抑菌浓度(MIC) 分别取不同蒸馏时间的香薷挥发油适量，加入无水乙醇溶解，制成 128 mg·mL-1的储备液，过滤除菌。用MH液体培养基将其稀释为640 μg·mL-1、320 μg·mL-1、160 μg·mL-1、80 μg·mL-1、40 μg·mL-1、20 μg·mL-1、10 μg·mL-1系列浓度。将0.5麦氏比浊标准的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌悬液稀释100倍，取100 μL菌液分别加入各浓度香薷挥发油溶液中。33 ℃倒置培养24 h，观察并记录各蒸馏时间各浓度挥发油的生长情况，与阴性对照组和阳性对照组进行比较，记录挥发油的MIC，实验重复3次。实验结果表明，各蒸馏时间香薷挥发油对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的MIC均在160～320 μg·mL-1，对铜绿假单胞菌的MIC均在320～640 μg·mL-1。

3 讨论

3.1 检测成分的选择 麝香草酚和香荆芥酚是香薷挥发油的主要成分[8]，具有较强的抑菌作用[9-10]，姚奕等[11]建议将两者作为香薷的质量标志物。《中国药典》2020年版一部对香薷药材中挥发油的总量进行了控制，但未对香薷挥发油中麝香草酚和香荆芥酚的含量进行测定，故课题组建立了香薷挥发油中麝香草酚、香荆芥酚的快速测定方法，以期为进一步控制香薷挥发油的质量提供参考。

3.2 色谱条件的选择 课题组参考相关文献[12-14]采用弱极性的Hp-5毛细管色谱柱测定了香薷挥发油中麝香草酚和香荆芥酚的含量，但在改变柱温、流速、流量后麝香草酚和香荆芥酚的分离度仍达不到要求，考虑到麝香草酚和香荆芥酚含有酚羟基结构，采用极性的PEG-INNOWAX毛细管色谱柱后麝香草酚、香荆芥酚及周围峰分离完全。此外，参考《中国药典》2020年版一部香薷药材中麝香草酚和香荆芥酚的含量测定方法，将柱温设为190 ℃时，麝香草酚和香荆芥酚色谱峰较宽、柱效低、峰形差、基于此笔者采用程序升温的方法对色谱条件进行了优化。初始柱温设为70 ℃，保持1 min，以降低溶剂效应；升温速度设为 20 ℃·min-1，升至210 ℃后保持10 min，使得麝香草酚和香荆芥酚在恒温平台期出峰，减少其峰面积的相对标准偏差。

3.3 麝香草酚和香荆芥酚含量对香薷挥发油抑菌活性的影响 李知敏等[2]曾测定江香薷挥发油和江香薷挥发油中麝香草酚、香荆芥酚、麝香草酚乙酸酯、对具伞花素等8个主要成分的单体对金黄色葡萄球菌的MIC，研究发现，只有麝香草酚、香荆芥酚和麝香草酚乙酸酯的MIC小于江香薷挥发油的MIC。本次实验结果表明，各蒸馏时间所得香薷挥发油中麝香草酚的含量均达60%以上，香荆芥酚的含量达12%以上，蒸馏时间为2 h、3 h、4 h、5 h的香薷挥发油中麝香草酚和香荆芥酚含量无显著性差异，香荆芥酚的含量略高于蒸馏时间1 h，各蒸馏时间香薷挥发油的抑菌活性无显著性差异。据此，课题组推测麝香草酚和香荆芥酚的含量对香薷挥发油的抑菌活性具有重要影响，具体影响作用有待进一步研究验证。

综上所述，麝香草酚和香荆芥酚可作为香薷挥发油质量控制的指标性成分，二者的含量可能对香薷挥发油的抑菌活性具有重要影响。蒸馏时间对香薷挥发油的提取率有显著影响，但对麝香草酚和香荆芥酚的含量和抑菌活性的影响较小。本次研究可为以抑菌活性为导向的香薷挥发油提取工艺的研究提供参考。