高效液相法对蛹虫草中虫草素的提取及含量测定

赵宇英

（厦门市食品药品质量检验研究院，福建 厦门 361000）

0 引言

通过对文献资料的分析，目前常见的测定蛹虫草中虫草含量的方式包括以下三种：薄层色谱法（TLC）、毛细管电泳法（CE）以及高效液相色谱法。高效液相色谱法是现阶段试验过程中的首选方法，与其他方式相比，测量结果的精准性较高，在前期操作处理中所用的操作不复杂。由于不同的物质具备不同的光谱，因此可以用作试验中的定性，由于二极管阵列检测器（DAD）可以实现在设定波长区域内的各波长之下采集数据信息，因此，当观察试验结果时不仅可以查看不同波长之下的色谱图，也可以看到不同时期的光谱图，对丰富试验数据的层次具有积极作用，该文主要研究在高效液相色谱图和DAD 检测器的基础上，针对蛹虫草中虫草素的定量、定性分析方法，并对需要分析的样品进行制备方法分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

根据高效液相色谱法的实际应用情况来看，该方法具有以下特点：第一，高压，由于流动相属于液体，在流经色谱柱的过程中受到的阻力较大，因此需要对载液施加高压；第二，高速，与其他液体色谱法相比，该方法检测速度较快，通常情况下，样品的分析工作可以在30min 之内完成；第三，高灵敏度，利用紫外检测器，灵敏度可以达到0.01ng；第四，适用范围较广，70%以上的有机化合物都适用于高效液相色谱分析法，尤其是大分子、高沸点、热稳定性较差的化合物。试验材料如下文所示。

虫草素标准品：纯度 99.9%，上海安谱试验科技股份有限公司生产。甲醇、甲酸、乙腈：色谱纯，德国默克股份公司生产。试验室用水为Milli-Q 超纯水。

虫草素标准储备液：精确称取干燥至质量恒定的虫草素标准品10mg（精确至0.0001g）于100mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度作为标准储备液，质量浓度为100ug/mL。再用超纯水分别稀释成不同浓度的虫草素标准溶液。

试验仪器主要有Waters2695 高效液相色谱仪、二极管阵列检测器DAD（美国Waters 公司）；Sartorius SQP QUINTIX 224-1CN 分析天平（瑞士 Mettler Toledo 公司）；HWS-28 电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；HD-1008A 和逹超声波（厦门和伟达超声波设备有限公司）。

试验样品：小麦、大米、蚕蛹粉3 种培养基质作为栽培的蛹虫草样品，每种1 个批次。

1.2 色谱条件

检测器：DAD 检测器；色谱柱：Sunfire C18 5μm（4.6 mm×250mm，美国Waters 公司）；柱温：35℃；流速：1.0mL/min；进样量：5μL；流动相：甲醇-甲酸-水（4 ∶1 ∶95，V ∶V ∶V）；检测波长：260nm；运行时间：10min；洗脱程序：等度洗脱。

1.3 标准曲线绘制

针对虫草素标准储备液进行梯度浓度的稀释方法：准确吸取0.5mL、1.0mL、3.0mL、6.0mL 和8.0mL 的虫草素标准储备溶液（100μg/mL）于10mL 容量瓶中，用水定容、摇匀，该标准曲线浓度为5.00μg/mL、10.0μg/mL、30.0μg/mL、60.0μg/mL 和80.0μg/mL，现用现配。每个进样重复3 次，以虫草素的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示质量浓度与峰面积呈现良好的线性关系，其中虫草素的回归方程为=38505+8952.2，=0.9993。

1.4 流动相的选择

采用不同比例的甲醇-水作为流动相，对样品中虫草素的分离效果进行比较，经反复试验，最终确定甲醇-水（16 ∶84，V/V），流速为1.0mL/min。

1.5 样品前处理

将蛹虫草子实体置于40℃烘干箱中烘干，经粉碎机粉碎后过200 目筛，在50mL 烧杯中加入粉末均匀的蛹虫草样品0.5g（精确至 0.0001g），加20%乙醇水溶液15mL，在超声波仪40℃的条件下超声提取3h，取出后用20%乙醇水溶液转移至20mL 容量瓶中摇匀并定容至刻度。样液离心后，将上清液过0.45μm 微孔滤膜，得到的滤液供高效液相色谱法使用。

1.6 提取条件的选择优化

虫草素的分子式为CHNO，该物质呈碱性，分子量为251，物质呈现出针状或片状结晶，其熔点在230 摄氏度左右，最大的吸收波长可以达到259nm。为了监测其波长，研究人员需要以甲醇为空白，选择在200nm～450nm 对混合虫草素的甲醇溶液进行紫外吸收扫描，扫描结果数据显示，虫草素在259.2nm～260.8nm 呈现出强吸收，可以使用二极管阵列检测器对先前的试验结果进行验证，能够保证试验结果的准确性以及灵敏度，该研究最终选择采用的测定波长为260nm，虫草素标准品和蛹虫草样品的色谱图如图1 和图2所示。

图1 虫草素色谱图

图2 蛹虫草样品色谱图

由于虫草素易溶于水、热乙醇和甲醇，因此固虫草素的溶剂通常是水、达到一定温度的乙醇溶液和甲醇。凌建亚等试验人员利用浸提法、索氏提取法、回流法以及超声法对虫草素进行了提取对比试验，试验结果主要包括以下几个方面：第一，浸提法对虫草素的提取效果不佳，需要耗费一定的时间，与其他提取方法相比，性价比较低，并不利于后续的试验操作；第二，在提取操作的时间方面，调整回流提取、超声法以及索氏提取法的结果相似，其中超声法的试验操作更便捷，不易受到外部环境因素的影响，该方法可以在试验中减少回流前后补足溶剂、定容等操作造成的试验误差。

为了比较三种提取方法的优劣，虫草素的提取方法设计了以下三种情况：1）以三种蛹虫草为材料，采用40℃条件下超声波水提法。2）40℃条件下超声波20%乙醇提法。3）40℃条件下超声波甲醇提法。在以上提取方法中选择虫草素的最佳提取方式，试验人员使用正交试验方法对提取温度、提取时间和提取次数这3 个影响因素进行分析，根据分析结果可以确定其最佳前处理样品的制备方法为取样后加入40 倍质量的20%乙醇水溶液并置于40℃的超声波仪中提取3h，3 种处理方式得到的结果见表1。

表1 3 种方法处理3 个样品得到的虫草素含量

将3 种培养基来源的蛹虫草样品称取 0.5g ，加入15mL的20%乙醇水溶液，在40℃条件下分别超声提取1h、2h、3h、4h、5h 后定容至20mL，最后通过高效液相色谱仪外标法进项定量，流动相采用甲醇和水的体系。采用液相色谱仪测定虫草素色谱峰面积，在260nm 波长下， 用提取时间（）对最终样液的色谱峰面积（）作图，如图3 所示。

图3 提取时间对提取效果的影响

在样品提取3h 后，基本可以将样品中的目标物提取出来，当实际操作更高浓度含量的样品时，可通过减少称样量、增大定容体积或者延长提取时间来充分提取样品中的虫草素。

在已经确定前处理方法后，接下来需要选择流动相。这次试验比较了几组流动相，分别为乙腈∶水（5 ∶95）、甲醇∶水（15 ∶85）、甲醇∶甲酸∶水（4 ∶1 ∶95），经试验结果分析比较，发现甲醇∶甲酸∶水（4 ∶1 ∶95）的试验条件下，虫草素与样品中的主要杂质和干扰物呈现出较好的分离效果，试验结果表明，在该条件下出峰时间更合适，形成的峰形较好，受到的外界因素干扰较小，更能达到良好的试验效果。在保证高回收率和灵敏度的同时缩短分析用时，最终选出最优的流动相为甲醇∶甲酸∶水（体积比为4 ∶1 ∶95）。

由于改变超声功率对虫草素的含量影响较小，因此，该试验选择试验仪器所能达到的最大超声功率700 W；提取次数对虫草素的影响较小，该试验结果表明：用水提取1 次，提取40min 即可将虫草素完全提取，提取2 次仅使虫草素分别增加了0.044 %、2.32%，因此一次提取即可满足分析要求。

2 结果与讨论

2.1 线性范围、最低检出限（LOD）与测量限（LOQ）

在完成最优色谱条件的筛选之后，试验人员需要分别使用已经稀释之后的标准样品溶液进行样品分析，每个样品都需要进行3 次重复性试验，取测试结果的平均值，对虫草素浓度（，μg/mL）与峰面积（）进行线性回归，得到虫草素浓度与峰面积的回归方程为=16197+2024，回归系数=0.999834。试验结果表明：虫草素的浓度在5μg/mL～80μg/mL，浓度与峰面积的线性关系良好。以低溶度标准样（5.0μg/mL）进样，得出信噪比（S/N）为103，检测限（方法）为7.5 mg/kg，定量限为22.5mg/kg。由于NY/T 2116-2012《虫草制品中虫草素和腺苷的测定高效液相色谱法》要求的检出限为10mg/kg，因此该方法的检出限更低，可满足实际样品检测的需求。

2.2 回收率和精密度

按照最优前处理方法，在液相色谱条件下进行前处理和上机检测，对样品SAM1、SAM2、SAM3 加标，进行12 次平行测量，回收率和精密度结果见表2。

表2 回收率和精密度的试验结果

虫草素在不同加标浓度下的加标回收率为97.64%～98.40%，RSD 为0.31%～0.42%，表明采用热的20%乙醇水溶液对蛹虫草样品进行超声提取、净化并采用甲醇、水、甲酸的体系的方法能够准确高效地测量蛹虫草中的虫草素含量。

2.3 重复性和稳定性试验

取相同样品五份，按试验要求制备成待测试液，在常温下每间隔2h 测定一次，连续测定7 次，试验表明样品平均峰面积变化不大，相对标准偏差为1.13%，样品溶液中虫草素在12h 内稳定性和重复性良好。

3 结论

该研究通过试验的方式对高效液相色谱法测定虫草素含量的前期处理进行分析，选择人工栽培的蛹虫草作为主要样本，根据试验结果，最终选定20%的40℃乙醇作为提取剂，高效液相色谱法可以实现虫草素含量的高效检测，试验操作更灵敏，更适合人工栽培的蛹虫草的虫草素检测工作。