循环肿瘤DNA检测在胃癌诊疗中的应用现状

王 芮， 李朝燕， 赵爱光

（上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032）

胃癌的发病率居常见恶性肿瘤的第4位，近年来呈逐年上升的趋势[1]，已成为世界范围内因肿瘤致死的第2大疾病[2]。我国是胃癌的高发地区[3]，但由于胃镜检查的有创性及早期筛查的不普及，我国早期胃癌检出率仅为10%[4]，约有40%的患者在被确诊时已处于晚期或已发生转移。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖类抗原（carbohydrate antigen，CA）125、CA19-9、CA72-4等血液肿瘤标志物诊断胃癌的敏感性和特异性均不高，临床应用受限。循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）由坏死或凋亡的肿瘤细胞释放到血液中，或由肿瘤细胞直接分泌，也可由外泌体释放。ctDNA携带与肿瘤相关的遗传信息，在胃癌的早期诊断、疾病进展和耐药监测、肿瘤复发和微小病灶评估方面具有指导意义。为此，本文对ctDNA的生物学特征和检测方法，及其在胃癌中的临床价值进行综述。

1 ctDNA的生物学特征和检测方法

1.1 生物学特征

c t D N A是一种无细胞状态的胞外游离DNA，由单链DNA、双链DNA或单双链混合DNA构成，存在于血液、脑脊液等体液中，是肿瘤细胞、原发肿瘤组织、转移灶通过坏死、凋亡或直接分泌的方式被释放到外周血中的循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA），ctDNA是cfDNA中携带肿瘤特有突变的小部分DNA，这些游离的片段携带肿瘤信息[5]。ctDNA存在于肿瘤患者的血液中，其检出率与肿瘤分期和体积成正比，而cfDNA的升高还可见于良性病变、炎症性疾病或创伤等情况。有研究结果显示，ctDNA片段的大小、结构有差异，因细胞凋亡产生的DNA片段多为70～200 bp，而细胞坏死产生的DNA片段较长，为200～21 000 bp。ctDNA在血液中可被快速清除，半衰期通常为15 min～2 h，因此可进行实时监测[6]。血液中的ctDNA主要通过循环酶、肾脏排泄，被肝和脾吸收后，经巨噬细胞降解等途径降解。ctDNA与蛋白复合物、胞外囊泡和血清蛋白的结合可能会影响其清除率，不同细胞摄取ctDNA的速率也可能会影响其清除率[7-8]。ctDNA携带肿瘤特异性基因特征和表观遗传学特征，如基因的突变、插入、缺失，染色体重排，拷贝数变异和甲基化改变等，因此ctDNA有成为肿瘤生物标志物的潜力。

1.2 检测方法

ctDNA仅占cfDNA的0.01%，含量极低，因此需要高敏感的检测方法。目前常用的检测方法为二代测序（next generation sequencing，NGS）和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）。NGS采用边合成边测序的方法实现对未知基因及突变的筛查，特点为高通量、高精度和高特异性，可在多个基因中检测到多个位点的突变，提供更加全面的基因组学信息，进一步提高了ctDNA的检测效率。ZHOU等[9]采用NGS检测结直肠癌患者ctDNA的单核苷酸变异数（single-nucleotide variation，SNV），证实该法可反映肿瘤异质性、评估术后肿瘤负荷，可用于追踪原发和转移性病灶。用于ctDNA检测的常用PCR方法为数字PCR。该法可对已知的靶基因及突变进行定量检测，测序精度较高，其衍生出的微滴式数字PCR可精确计算出靶分子的拷贝数和浓度[10]。目前，已有许多基于微滴式数字PCR的商品化检测系统，如Raindrop digital PCR（美国RainDance Technologies公司）、QX200 Droplet Digital System（美国伯乐公司）和Naica System（法国Stilla Technologies公司）[11]。此外，BEAMing技术也是较常用的PCR技术，其将数字化PCR与流式技术相结合，利用磁珠与微乳滴结合的原理，对ctDNA进行绝对定量检测。另外，由于血液中的ctDNA半衰期较短（15 min～2 h），需要快速处理，因此检测样本首选血浆，以避免基因组DNA的 污染[12-13]。

2 ctDNA在胃癌诊断中的应用

多数胃原位癌经根治性手术后可被治愈，但一旦发生转移，即使有手术指征，预后也普遍较差。因此，肿瘤研究的重要目标之一是尽早识别肿瘤，以实施治疗。ctDNA作为血液学指标，可在胃癌诊断方面发挥一定的作用。

COHEN等[14]研发出一个名为CancerSEEK的检测方法，即将ctDNA与血液中的蛋白指标结合起来，以实现在肿瘤转移前诊断，并定位原发灶，提高根治性手术的治愈率；结果显示，CancerSEEK对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期肿瘤诊断的中位敏感性分别是43%、73%、78%，受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线提示在62%的受试者中，该方法的特异性＞99%，该法可增加诊断敏感性，同时不会降低特异性。LI等[15]采用ctDNA测序筛选出胃癌的高频突变基因KMT2D，体外实验证实该基因可能是一种促进胃癌细胞增殖的癌基因，可初步用于胃癌的诊断。有Meta分析结果显示，ctDNA诊断胃癌的合并敏感性[95%可信区间（confidence interval，CI）]和合并特异性（95%CI）分别为62%（59%～65%）、95%（93%～96%），因此特定ctDNA基因突变类型与胃癌瘤体增大及疾病进展等不良事件的发生有关[16]。

表观遗传学改变常发生在肿瘤初期，甲基化是表观遗传学的重要组成部分，因此可通过ctDNA甲基化检测进行肿瘤诊断。LING等[17]的研究结果显示，ctDNA XAF1甲基化与胃癌密切相关，或可用于胃癌的诊断。有学者对液体活检技术在胃癌应用方面的文献进行了研究，发现有大量证据支持ctDNA可作为胃癌初步诊断的生物标志物，其诊断价值优于循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）[18]。ctDNA用于早期肿瘤诊断的挑战之一是其检测的敏感性，因为无症状个体的ctDNA水平通常较低，因此需要使用大量的血液样本，或使用高敏感的检测方法，如微滴式数字PCR和NGS[19]。目前，ctDNA在胃癌诊断方面的研究仍处于探索阶段，需要更多的研究证实其有效性。另外，相关检测技术也有待进一步改进。

3 ctDNA在胃癌患者靶向治疗、疗效监测、耐药机制中的作用

胃癌存在很大的异质性，提取的部分组织样本不能反映整个肿瘤的病理组织和基因信息，且原发肿瘤的基因概况与转移灶有可能不一致。在肿瘤治疗的不同阶段，需要反复检测相关基因，以了解耐药的分子因素和可适用的新治疗靶点。ctDNA检测有助于胃癌的纵向监测和分析，以实现个体化治疗方案的定制和管理。

3.1 ctDNA在胃癌患者靶向治疗筛选和疗效监测中的作用

人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）是一种跨膜的络氨酸激酶受体，有6%～23%的胃癌患者过表达HER-2，曲妥珠单抗治疗HER-2阳性胃癌患者的有效性已被证实[20]。筛查HER-2水平的传统方法是采用病理学方法对获取的胃癌组织样本进行检测。但由于胃癌本身的异质性及取材部位的差异，无法确保检测结果的准确性，可能会漏掉部分存在曲妥珠单抗治疗指征的患者。ctDNA能克服肿瘤异质性的影响，对肿瘤异质性状态进行监测和评估。SHODA等[21]使用微滴式数字PCR检测胃癌患者ctDNA中HER-2拷贝数的变化，以RPPH1为参考基因，将RPPH1与HER-2的比值称为HER-2率，结果显示，随着胃癌的进展或复发，HER-2率持续升高，ctDNA可筛选出HER-2阴性但在复发后逆转的胃癌患者。WANG等[22]收集了78例胃癌患者的组织样本和配对的血液样本，检测了HER-2的拷贝数和突变数，结果显示，血液样本与组织样本具有较高的一致性 （P=0.000 39），ctDNA可用于检测血液中HER-2基因的SNV和拷贝数。PECTASIDES等[23]的研究结果显示，原发性胃食管肿瘤组织与转移灶配对样本中的基因突变差异很大，他们进一步对基因测序结果存在差异的患者进行ctDNA检测，发现转移灶中的靶基因突变与ctDNA的一致率达87.5%，因此建议将ctDNA测序作为选择分子靶向药物治疗的标志物。由此可见，采用ctDNA对胃癌患者进行靶向治疗的筛选是可行的，临床可根据每个胃癌患者的不同情况，在治疗进程中使用ctDNA评估患者不同时间段的基因变异水平，以不断完善治疗方案。

LIU等[24]的研究结果显示，利用组织样本测序与采用血液样本进行微滴式数字PCR检测得到的HER-2扩增一致率为81.4%；他们对12例行FOLFOX+曲妥珠单抗治疗的胃癌术后患者随访1年，每2个月检测1次HER-2拷贝数状态，发现经过2个月的治疗后，HER-2率显著降低（P＜0.000 1），而当胃癌发生进展时，HER-2率较未进展时增高2.3～4.1倍，12例胃癌患者的中位无进展生存时间（progressionfree survival，PFS）为9.8个月。由此可见，采用微滴式数字PCR检测胃癌患者不同临床进程中的血浆HER-2率，可反映疾病进展和治疗效果。AGUILAR-MAHECHA等[25]通过监测1例HER-2阳性胃癌患者ctDNA水平的HER-2拷贝数和PIK3CA突变，发现HER-2拷贝数与药物反应和疾病进展的联系优于CEA，建议将ctDNA检测作为监测HER-2阳性患者治疗反应的方法之一。还有学者研究了ctDNA在预测胃癌患者对免疫治疗不良反应中的作用，结果显示，接受免疫治疗后血浆ctDNA阳性患者的中位PFS为7.4个月，显著长于血浆ctDNA阴性的患者（4.9个月）（P=0.025）；从ctDNA中发现CEBPA、FGFR4、MET、KMT2D基因突变的患者发生免疫相关不良反应的可能性更大（P=0.09），因此ctDNA可用来监测免疫治疗的效果[26]。虽然有较多研究证实ctDNA可用于指导治疗和疗效监测，但仍需要大样本量研究来证实其有效性。

3.2 ctDNA在阐述耐药机制中的作用

液体活检可被用来分析由原发肿瘤异质性引起的曲妥珠耐药，并解释因新的分子突变而导致的耐药。WANG等[27]通过检测胃癌患者ctDNA，发现了32个与曲妥珠耐药相关的突变基因，并提出可用于预测疾病进展的肿瘤分子负荷指数（molecular tumor burden index，mTBI）；他们将mTBI分为3个不同的级别，由低到高依次为相关的基因突变、激活的基因或通路、突变基因出现扩增；揭示了胃癌患者对曲妥珠单抗的耐药机制，其中EGFR、MET的SNV与曲妥珠单抗耐药密切相关。SHAHJEHAN等[28]采用ctDNA基因型检测来监测HER-2阳性胃癌患者对曲妥珠单抗的耐药性，结果显示，有76.5%的患者存在多种耐药机制，这些患者在接受曲妥珠单抗治疗时PFS较短。DU等[29]采用NGS对胃癌患者的ctDNA进行测序，结果显示，存在MET扩增的胃癌患者对克唑替尼的耐药机制包括MET扩增和MET的多重二次突变，这也是患者病情恶化的原因。ZHANG等[30]的研究结果表明，基于ctDNA检测得到的ERBB2特定位点突变（V659D和L7555S）可能会导致胃癌患者对派洛替尼获得性耐药，但该结果仍需进一步验证。肿瘤患者病情的快速进展可能是由于获得性耐药突变和预先存在的肿瘤分子异质性导致的。肿瘤患者对抗肿瘤药物的耐药机制是复杂且多样的，因此全面分析分子特征对于肿瘤患者治疗策略的制定极为重要。ctDNA检测有助于阐明肿瘤患者对抗肿瘤药物的耐药机制。

4 ctDNA对胃癌根治术预后的评估

在经根治术治疗后，仍有20%～50%的胃癌患者可能会发生局部复发或远隔转移，因此寻找一个有效的预测因子来识别复发高危人群非常重要。ctDNA可用于追踪胃癌根治术后微小残余病灶，预测复发转移。有研究结果显示，基线ctDNA水平及ctDNA中基因突变数的增加与胃癌进展期患者不良预后和多位点转移有关，ctDNA或可用于评估胃癌患者的治疗反应[22]。KIM等[31]通过动态监测19例胃癌根治术患者术后12个月内的血液ctDNA水平，发现术后12个月内ctDNA阳性与胃癌复发相关（P=0.029），且预示胃癌复发的中位时间较临床复发缩短了4.5个月，术前ctDNA阳性与胃癌复发无关。有Meta分析结果显示，ctDNA与胃癌患者较短的总生存期和PFS密切相关，提示出现一定量的ctDNA预示着预后不良[16]。LI等[32]的研究结果表明，通过ctDNA检测发现TP53突变和MET基因扩增可用于预测胃癌进展期患者的不良预后。

5 ctDNA检测的不足和应用展望

虽然有较多研究证实ctDNA可在胃癌的早期筛查和诊断、靶向药物选择、疗效和复发监测、预后评估等方面发挥作用，但ctDNA检测的局限性仍不容忽视：（1）ctDNA检测目前主要依赖于深度NGS，成本较高；（2）ctDNA在外周血中的丰度较低，不同检测平台的敏感性和特异性存在较大差异，缺乏统一的判断标准，不同实验室之间检测结果的可比性较差，结果的准确性、可靠性和再现性是不可忽视的问题，需要专门的技术支持；（3）目前尚无临界值来区分高浓度和低浓度，血液样本保存不当容易导致ctDNA降解，因此需要建立一套标准化的检测流程；从预分析阶段开始，各处理步骤，包括血浆体积、储存温度、采血至血浆分离的时间间隔、离心方案和纯化方法都有可能影响最终的检测结果[33]。

液体活检是未来肿瘤研究的重要领域之一，但仍缺乏前瞻性、大样本量的研究，且肿瘤不同分型之间存在固有的异质性。目前有关胃癌的研究仍较少，这可能与胃癌发生、发展中复杂的多阶段、多因素过程，较大的瘤内异质性，涉及大量肿瘤相关基因结构改变与表达异常有关。本研究总结了胃癌中基于ctDNA检测发现的有价值的分子标志物及其作用[13，34-36]，具体结果见表1。通过ctDNA识别肿瘤基因和表观遗传学的变化，并将其应用到胃癌的诊断、治疗、疗效监测及预后评估中，会使胃癌的个体化治疗迈上一个新台阶。另外，除评估肿瘤组织样本检测与液体活检的一致性外，还需要针对不同亚型的肿瘤单独研究ctDNA的价值和可行性，以更好了解其优势与局限。

表1 ctDNA识别胃癌分子标志物的相关研究概览