高脂膳食诱导胰岛素抵抗对APP/PS1转基因小鼠氨基酸稳态的影响

刘锐，李子衿，费安奎，张译文，王乐宇，李克俭，刘智

（江汉大学医学院，湖北 武汉 430056）

阿尔兹海默病（Alzheimer′s disease，AD），又称老年痴呆症，是一种中枢神经系统退行性疾病，主要临床表现为记忆和认知功能障碍、行为及人格异常改变，是最常见的痴呆类型。现有流行病学调查结果显示，我国65岁以上老年人AD发病率为6.25‰［1］，患病率为5.14%～7.30%［2］。随着人口老龄化进程的加速，其发病率还将不断增加。但迄今为止其发病机制尚未阐明，使得其防治成为世界性的难题。AD发病机制复杂，现普遍认为是一种多因素所致疾病，其中，胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是AD病程发展过程中的早期重要事件［3-4］，其在AD中的作用受到广泛关注，而具体机制仍有待深入研究。

近年来，IR介导的代谢异常在AD病理损害机制中的作用受到越来越多的关注，AD逐渐被认为是一种神经代谢性疾病，也被称为3型糖尿病［5］。因此，从代谢角度研究和认识AD将为其发病机制研究提供新的线索。但现有研究主要关注糖、脂代谢异常。值得注意的是，除了调节糖、脂代谢，胰岛素信号通路也是体内氨基酸代谢的重要调控者。脑是氨基酸利用的重要靶器官，体内氨基酸通过参与神经递质的生成、能量代谢、神经信号传导等对维持正常的神经功能至关重要［6］。目前，关于AD发展过程中IR对氨基酸代谢影响的研究非常有限。因此，本研究拟以对AD易感的APP/PS1双转基因小鼠为研究对象，通过高脂膳食喂养建立IR模型，观察IR对APP/PS1 AD模型小鼠氨基酸稳态的影响，为进一步从代谢角度研究和认识AD提供线索和理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

Aβ40/Aβ42 ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）、甲醇（美国Thermo Fisher公司）、乙腈（美国Thermo Fisher公司）、异丙醇（美国Thermo Fisher公司），超高液相色谱仪（美国Waters公司）、Xevo TQ-S质谱仪（美国Waters公司）。

1.2 实验动物分组及饲养

20只SPF级雄性3月龄APP/PS1小鼠，购买于北京华阜康生物有限公司，饲养于江汉大学医学院实验动物中心，环境温度（20±5）℃，相对湿度（50±10）%，明暗交替周期为12 h，小鼠自由饮水和进食。适应性喂养一周后，按体重随机分为对照组（normal diet，ND）和高脂组（high-fat diet，HFD），分别喂饲普通饲料和高脂饲料。实验饲料均由北京华阜康生物有限公司提供，普通饲料和高脂饲料分别参照Research Diet公司D12450B和D12451配方配制。喂养期间每日记录小鼠进食量，每周监测并记录体重。实验20周后，进行胰岛素耐量（insulin tolerance testing，ITT）和葡萄糖耐量试验（glucose tolerance testing，GTT）并分别计算血糖曲线下面积，评价胰岛素敏感性。实验结束后，断头取血，留取血清和海马组织，经液氮速冻后-80℃保存，用于后续相关指标测定。

1.3 指标检测

1.3.1 GTT和ITT实验20周末，小鼠禁食10 h，尾静脉穿刺取血，丢弃第一滴血，血糖仪测定空腹血糖（G0），2 g/kg.bw的葡萄糖溶液（w/v 50%）灌胃或腹腔注射0.75 IU/kg.bw胰岛素溶液（200 IU/L），分别测定和记录各组干预后15 min（G15）、30 min（G30）、60 min（G60）和120 min（G120）的血糖值，计算血糖曲线下面积（area under the curve，AUC），计算公式为：AUC=（G0+G120）/2+G15+G30+G60。

1.3.2 ELISA法检测海马淀粉样蛋白Aβ40和Aβ42含量取各组小鼠海马组织，匀浆后取上清，参照试剂盒说明书ELISA法测定各组Aβ40和Aβ42水平。

1.3.3 超高液相色谱-串联质谱法（ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）检测血清氨基酸水平每只小鼠各取25 μL血清加入96孔板，加入100 μL含内标物的冰冷甲醇，剧烈涡旋5 min，4000 g离心30 min。取30 μL上清液转移至干净的96孔板中，每孔加入20 μL新鲜制备的衍生剂，密封后在30℃衍生化60 min。结束后，加入350 μL冰冷的50%甲醇溶液稀释样品，-20℃储存20 min后离心，取上清转移至新的96孔板，每孔加入15 μL内标，将板密封进行HPLC-MS/MS分析。

1.3.4 透射电镜观察海马超微结构小鼠处死后低温迅速分离海马组织，置于有预冷固定液的蜡板上，将其切割为1 mm×1 mm×1 mm小块，放入2.5%戊二醛溶液中固定4 h后，0.1 mol/L磷酸缓冲液清洗3次，锇酸固定，梯度脱水，环氧树脂浸泡、包埋、聚合，超薄切片机切片，铀铅双染色，透射电镜观察。

1.4 统计学方法

数据分析采用统计学软件SPSS19.0。符合正态分布的计量资料采用均数±标差（xˉ±s）表示，两组间均数比较采用两独立样本的t检验；非正态分布的计量资料组间比较采用Mann-WhitneyU非参数检验；以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 体重和进食量

高脂饲料喂养组小鼠每天的能量摄入量高于正常饲料喂养组（P＜0.05）（图1A），从第9周开始高脂组小鼠体重显著高于正常饲料喂养组（P＜0.05）（图1B）。

图1 各组小鼠体重和能量摄入量Fig.1 Body weight and calorie intake of mice in each group

2.2 胰岛素敏感性评价

高脂饲料喂养20周，分别进行ITT和GTT试验。ITT试验结果（图2A、图2B）显示，HFD组小鼠0、15、30、60 min血糖值及AUC均显著高于ND组（P＜0.05）。GTT试验实现结果（图2C、图2D）显 示，HFD组 小鼠0、15、30、60和120 min血糖值 及AUC均 显 著高于ND组（P＜0.05）。结果表明HFD组小鼠胰岛素敏感性降低，出现胰岛素抵抗。

图2 各组小鼠胰岛素敏感性比较Fig.2 Comparison of insulin sensitivity of mice in each group

2.3 高脂诱导胰岛素抵抗APP/PS1小鼠海马淀粉样蛋白Aβ生成及超微病理结构变化

细胞外由β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）构成的老年斑沉积是AD典型的神经病理学变化。高脂喂养20周，HFD组小鼠海马Aβ40和Aβ42含量均显著高于ND组（P＜0.05）（图3A）；海马CA1区超微病理结果（图3B）显示，与ND组小鼠海马结构相比，HFD组小鼠海马突触数量减少，突触前膜、后膜、突触小泡结构不清、模糊，部分轴突和树突失去膜性结构。

图3 高脂诱导胰岛素抵抗APP/PS1小鼠海马淀粉样蛋白Aβ生成及超微病理结构变化Fig.3 Effects of high-fat diet-induced insulin resistance on Aβ production and ultrastructure in the hippocampus of APP/PSI mice

2.4 高脂诱导胰岛素抵抗APP/PS1小鼠血清氨基酸水平的变化

20种氨基酸检测结果见表1。与对照组小鼠相比，高脂组血清亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸和丝氨酸水平均显著降低（P＜0.05）。

表1 对照组和高脂组血清中20种氨基酸的含量 /（μmol·L-1）Tab.120 kinds of serum amino acids concentration in ND and HFD-fed mice

3 讨论

胰岛素以及相关的信号传导通路异常与AD的病理进程有着密切的联系［7-8］。研究［9-10］发现，高脂饮食诱导的IR加剧AD特征性病理改变和认知功能障碍。本研究结果同样显示，高脂诱导的IR组APP/PS1小鼠海马淀粉样蛋白Aβ生成增加，海马区域病理结构破坏加重。

IR通过多种机制参与AD的发生［11］，近年来，IR引起的早期代谢异常受到广泛关注，被认为可能是导致AD病理改变的上游机制。胰岛素及其信号通路是调节体内氨基酸水平的重要因素，而氨基酸的稳态对维持正常神经功能至关重要。氨基酸水平的异常可通过介导氧化应激水平、调节线粒体功能、影响神经递质合成等导致神经功能障碍［5］。已有多个代谢组学研究先后报道AD动物模型及患者血和脑组织氨基酸水平的改变［12-13］，但研究结果不尽一致。本研究通过高脂膳食诱导IR，结果表明IR的APP/PS1小鼠空腹血清四种生糖氨基酸（半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸）及两种支链氨基酸（亮氨酸和异亮氨酸）水平均显著降低。研究表明，支链氨基酸可通过与芳香族氨基酸的竞争影响多巴胺、肾上腺素和5-羟色胺等神经递质的合成。此外，支链氨基酸（尤其是亮氨酸）也是氮的重要供体，参与调节兴奋性神经递质谷氨酸的合成［14］。一项多个队列研究的综合分析结果表明，支链氨基酸水平与AD发病风险呈负相关［15］。丝氨酸是D-丝氨酸的前体，而D-丝氨酸是突触可塑性所必需的N-甲基-D-天冬氨酸受体的协同激动剂，丝氨酸水平的降低与AD认知功能降低有关［16］。谷氨酰胺是AD脑糖代谢受损时主要的替代能源之一［17］。半胱氨酸参与抗氧化物质谷胱甘肽的合成［18］。尽管上述氨基酸在脑组织中具有重要功能，但其水平的降低与IR引起的认知功能损伤之间的因果关系以及相关机制仍有待深入研究。有研究认为，AD患者由于脑内胰岛素受体表达水平下降，导致脑组织糖利用能力下降，能量代谢障碍。而由于神经元缺乏脂肪酸β氧化的酶，一方面氨基酸可作为暂时性能量来源来弥补脑糖代谢的异常，补充大脑所需能量，而另一方面氨基酸代谢改变导致的代谢产物增加具有神经毒性［6］。

综上所述，胰岛素抵抗加剧AD病理改变，并伴有氨基酸水平的异常，但未来仍需要更多的研究来阐明两者之间的因果关系和潜在机制，从而为AD的发病机制研究提供新的线索和思路。