种子萌发期粳稻种质资源耐旱性综合评价

张娟伟 石亚飞 路旭平 杨文伟 田 蕾 李培富 张振海 罗成科,*

(1 宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021；2 宁夏农林科学院农作物研究所，宁夏 银川 750021)

西北干燥区单季稻作区为我国六大稻作区之一，在我国粮食生产中具有不可替代的作用[1]。宁夏引黄灌区是西北干燥区单季稻作区主要稻区之一，该区域热量充沛、昼夜温差大，光温条件好，灌排便利，发展单季稻生产具有得天独厚的优势[2]。尽管该区域水稻种植面积较小，但出产的稻米高产优质，已被列为优质粳稻最佳生态区之一[3]。水稻是高需水作物，对水分缺失较为敏感，水分不足会明显影响水稻的生长发育和产量。水稻生活史的起始阶段是萌发期，该时期种子发育的好坏对随后的成苗效果起着决定作用，以萌发期作为关键时期进行水稻种质资源耐旱性鉴定，有助于挖掘水稻耐旱种质资源和培育耐旱品种，对提高作物水分利用效率、保证干旱易发地区稻谷的产量稳定具有重要意义。

聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)作为一种理想的渗透调节剂，被用于模拟干旱胁迫处理水稻种子萌发[4]，耐逆育种工作者往往通过测定胁迫处理后的根、芽有关形态指标，进行水稻萌发期耐旱性鉴定。在进行水稻萌发期或芽期耐旱性鉴定指标的筛选研究中，王贺正等[5]认为相对芽长和相对芽干重与品种的耐旱性紧密相关，这两个形态指标可以作为鉴定水稻耐旱性的评价指标；李其勇等[6]筛选出储藏物质转化率可作为一级耐旱鉴定指标，活力指数和D值为二级耐旱鉴定指标；田又升等[7]分析认为，胚芽干重、发芽率、胚芽鞘长和根冠比均可作为耐旱主要指标；翟荣荣等[8]和袁杰等[9]的研究结果均表明，相对发芽率、相对芽长和相对根长为耐旱鉴定的3个重要指标；敬礼恒等[10]对湖南省内推广的12个籼稻品种萌发期的耐旱性鉴定结果表明，相对发芽率、相对芽长、相对根长、相对根芽干重和种子萌发耐旱指数均可作为耐旱评价关键指标。

本研究结合以上文献报道，选择相对发芽势、相对发芽率、相对芽长、相对根长、相对根芽干重、相对根芽鲜重、活力指数、萌发耐旱指数8个根、芽形态指标进行试验。首先筛选出水稻萌发期模拟干旱胁迫(PEG-6000)的适宜浓度，然后针对139份不同来源粳稻种质资源进行萌发期耐旱性鉴定。在此基础上，利用主成分分析法、隶属函数结合权重分析法对这些种质资源的耐旱性进行综合评价，以期鉴定出较为理想的耐旱种质，为西北干燥区单季稻作区耐旱新品种选育提供耐旱种质资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选用的139份粳稻种质资源主要来源于我国不同省份(103份)，少量来自其他各国，其中法国2份、葡萄牙2份、阿尔巴尼亚1份、南斯拉夫1份、澳大利亚2份、美国1份、巴西1份、孟加拉国1份、韩国4份、朝鲜4份、日本17份，具体信息见表1。

表1 139份粳稻种质资源信息及萌发期耐旱性表现

1.2 试验方法

试验前先对各种质资源种子进行42℃预处理 2 d，打破种子休眠，然后挑选均一、饱满和健康的各种质资源种子150粒(3次重复，每个重复50粒)，用10%次氯酸钠溶液消毒30 min，蒸馏水冲洗5次后，将其分别接种于含有蒸馏水(对照)和PEG-6000溶液(模拟干旱)浸湿的双层滤纸培养皿中，置于人工气候箱中发芽培养。培养条件为28℃光照12 h/26℃黑暗12 h。胁迫处理期间，每天进行不同溶液更换以保证胁迫浓度的稳定性，胁迫处理共8 d。

为了筛选模拟干旱胁迫的PEG-6000溶液的最佳浓度，在前期预备试验并结合前人报道[11]的基础上，将宁粳7号、宁粳9号、宁粳36号暂定为萌发期耐旱种质，将宁粳16号、富源4号、长白9号暂定为萌发期旱敏感种质，以这6份种质为供试材料，设置PEG-6000溶液浓度梯度分别为0%、5%、10%、15%、20%进行最佳浓度筛选试验，获得的最佳浓度用于139份粳稻种质资源萌发期耐旱性鉴定。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 萌发指标测定 以胚根长度与种子等长、胚芽长度为种子长度一半为发芽标准[12],每日定时测定发芽种子数。根据以下公式计算发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、种子萌发指数、萌发耐旱指数：

发芽势=第4天发芽种子数/供试种子总数

(1)

发芽率=第8天发芽种子数/供试种子总数

(2)

发芽指数=∑(DG/DT)

(3)

式中，DG为逐日发芽种子数，DT为相应DG的发芽天数，计数至第8天。

活力指数=发芽指数×(芽长+根长)

(4)

萌发耐旱指数=水分胁迫下种子萌发指数/对照种子萌发指数

(5)

式中，种子萌发指数=(1.00)nd2+(0.75)nd4+(0.50)nd6+(0.25)nd8，其中nd2、nd4、nd6、nd8分别为第 2、第4、第6、第8天的种子发芽率，1.00、0.75、0.50、0.25 分别为相应萌发天数所赋予的权重系数。

根芽性状：处理后第8天在各培养皿内随机选取15粒已发芽的种子，计算各种子的芽长、根长，称量鲜重后105℃烘箱内杀青0.5 h，80℃烘至恒重后称量干重。

1.3.2 根、芽相关指数计算方法 针对不同处理，随机挑取模拟干旱处理后第8天已发芽的种子15粒，分别统计各种子的芽长和根长，以及根和芽的鲜重，称量鲜重后将它们分别置烘箱内烘干至恒重，称量根和芽的干重。根据公式计算各指标耐旱系数(drought coefficient，DC)：DC=胁迫指标测定值/对照指标测定值。计算出的相对发芽势、相对发芽率、相对根长、相对芽长、发芽指数、相对根芽鲜重、相对根芽干重和活力指数均用于后续试验分析。

1.4 数据统计分析

使用Excel 2010软件进行数据统计，利用 SPSS 20.0 软件进行方差分析、相关性分析和主成分分析，利用TBtools软件进行聚类分析，采用隶属函数结合权重分析法进行萌发期耐旱性综合评价。综合评价过程中用到的隶属函数值、各指标的权重、综合耐旱能力D值的具体计算方法和公式见参考文献[13]。

2 结果与分析

2.1 模拟干旱胁迫PEG-6000最佳浓度筛选

本试验初步选择了3个耐旱和3个旱敏感种质，利用不同浓度PEG-6000胁迫6份种质的种子萌发。结果表明，5% PEG-6000对旱敏感种质的发芽影响不明显，当浓度为10%～20%对旱敏感种质的发芽影响显著，而对耐旱种质来说，5%～10% PEG-6000对其发芽影响不显著，当浓度在15%～20%之间时耐旱种质的发芽明显受到影响。随着PEG-6000浓度的不断增加，萌发期耐旱、旱敏种质的大多数耐旱相关指标基本呈现下降趋势。其中，与低浓度胁迫(5% PEG-6000)相比，15%浓度胁迫下旱敏感种质的大多数耐旱相关指标(相对发芽势、相对芽长、相对根芽鲜重、相对根芽干重、活力指数、萌发耐旱指数)均存在显著差异(P<0.05)，耐旱种质中有一半耐旱相关指标(相对根长、相对芽长、相对根芽鲜重、相对根芽干重)存在显著差异(P<0.05)(表2)。此外，试验还观察到，20% PEG-6000浓度严重抑制了不同种质的萌发。因此，本研究选择15% PEG-6000作为种子萌发期粳稻种质资源耐旱性鉴定的最佳浓度。

表2 不同 PEG-6000 浓度下不同种质萌发期耐旱相关指标统计分析

2.2 种子萌发期粳稻种质资源耐旱相关指标分析

利用15% PEG-6000模拟干旱胁迫粳稻种质资源的种子萌发，统计分析8个耐旱相关指标在139份材料间的变异情况，结果表明，耐旱相关指标的变异系数介于13.2%～53.0%之间，变异系数从大到小依次为：活力指数>相对芽长、相对根芽鲜重>相对根长>相对根芽干重>相对发芽势>萌发耐旱指数>相对发芽率。其中，活力指数在品种间差异最大，变异系数为53%，相对发芽率在品种间差异最小，变异系数为13.2%。除了相对发芽率外，其他耐旱相关指标的变异系数均大于25%(表3)。说明这些指标在139份种质资源之间存在着丰富的变异，可作为重要的粳稻耐旱性筛选指标。

表3 粳稻种质资源萌发期耐旱相关指标分析

2.3 种子萌发期粳稻种质资源耐旱性指标相关性分析

针对萌发期8个耐旱相关指标，如相对发芽势、相对发芽率、相对根长、相对芽长、相对根芽干重、相对根芽鲜重、萌发耐旱指数和活力指数进行相关性分析。8个耐旱相关指标间均呈极显著正相关，其中，相对发芽势与萌发耐旱指数、相对发芽势与相对发芽率、活力指数与萌发耐旱指数、相对发芽率与萌发耐旱指数、相对根长与活力指数、相对芽长与活力指数，两两指标之间的相关系数均达到0.6以上(表4)，说明这些指标的变化趋势具有一致性。

表4 粳稻种质资源萌发期耐旱指标间的相关性分析

2.4 种子萌发期粳稻种质资源耐旱性主成分分析

本研究对萌发期 8个耐旱相关指标进行了主成分分析，结果如表5所示。CI1、CI2、CI3、CI44个主成分的特征值分别为4.190、1.246、0.743和0.619，均大于0.6，累计贡献率达到84.963%，能充分概括大多数指标，符合指标选择的原则[14]，因而提取这4个主成分进行分析。在主成分1中，相对发芽势、相对芽长、活力指数和萌发耐旱指数的载荷值较高，均在0.73以上，这4个指标是该主成分的主要作用因子。在主成分2中，相对发芽率、相对发芽势的载荷绝对值分别是0.495和0.487，这两个指标为该主成分的主要作用因子。而在主成分3中，仅有相对根芽鲜重表现出较高的载荷值(0.738)，可以作为该主成分的作用因子。在主成分4中，相对根芽干重的载荷绝对值也表现的较高(0.556)，能够作为该主成分的作用因子。综合考虑，将相对发芽势、相对芽长、活力指数及萌发耐旱指数4个指标作为种子萌发期粳稻种质资源耐旱性评价的关键指标。

表5 主成分贡献率及特征向量

2.5 种子萌发期粳稻种质资源耐旱性综合评价

利用139份粳稻种质资源萌发期耐旱性的综合指标值(CI1～CI4)分别计算隶属函数值。根据萌发期各综合指标贡献率的大小，依次求出4个综合指标的权重，分别为0.616、0.183、0.109和0.091。用上述4个隶属函数值与权重的乘积并累加得到综合评价值(D)，并根据D值对139份粳稻种质资源萌发期的耐旱性进行排序(表1)。

由结果可知，139份粳稻种质D值范围介于0.109～0.891之间，其中，D≥0.81的种质有No.128(松粳3号)、No.127(通院515)、No.129(龙粳807)、No.44(松粳20)、No.11(Farry)，可以将上述种质视为萌发期耐旱能力强的种质资源；D值≤0.19的种质资源有No.35(京引58)、No.31(Calrose)、No.93(宁大15149)、No.66(新稻10号)、No.102(山形86)。D值在一定程度上能够客观反映出种子萌发期各粳稻种质资源耐旱性的强弱。一般而言，D值越大，耐旱性越强。因此，本研究认为上述种质为萌发期耐旱能力弱的种质资源。

2.6 种子萌发期粳稻种质资源耐旱性相关指标的聚类分析

根据D值大小将139份粳稻种质资源分成三种类型，分别为耐旱种质(0.698

图1 基于4个萌发期耐旱关键指标及D值的139份粳稻种质资源聚类图

2.7 种子萌发期粳稻种质资源耐旱性地域差异比较

139份粳稻种质资源广泛分布于欧美、日韩、中国。为了进一步分析这些粳稻种质资源萌发期的耐旱性是否存在地域差异，对萌发期耐旱性4个关键指标分别进行地域差异显著性分析。结果表明，来自欧美的种质资源的相对发芽势、相对芽长及萌发耐旱指数均显著低于日韩和中国(P<0.05)，种质资源表现为旱敏感表型；日韩种质资源的相对发芽势、相对芽长、萌发耐旱指数和D值与中国无显著差异(P>0.05)，这两种地域的种质资源均表现为中等耐旱表型(表6)。

表6 不同区域粳稻种质资源萌发期耐旱性差异比较

进一步对来源于我国不同稻作区的种质资源进行耐旱性差异分析，结果表明不同稻作区的种质资源的耐旱关键指标、D值差异不显著(P>0.05)，总体表现出中等耐旱表型(表7)，种子萌发期不同稻作区种质资源耐旱性无明显地域差异，不同稻作区个别种质资源表现出的明显表型差异可能与其所属地的特殊气候、地貌特征、地理位置等自然生态条件相关。

表7 不同稻作区粳稻种质资源萌发期耐旱性差异比较

3 讨论

3.1 种子萌发期粳稻种质PEG-6000浓度的筛选

PEG-6000是一种理想的渗透调节剂，其通过调节溶液的渗透压进而限制水分进入种子，从而影响水稻种子的萌发，以达到水分胁迫的目的[15]，PEG-6000已被广泛用于萌发期水稻耐旱资源的筛选与评价[16-18]。由于水稻类型、水稻品种、种子处理方法和培养条件的不同，筛选得到的PEG-6000浓度也有所不同。彭朝才等[19]和李其勇等[6]利用不同浓度PEG-6000分别对贵州和四川籼稻进行芽期和萌发期干旱胁迫处理，表明PEG-6000的最适浓度为20%，而旱稻芽期干旱胁迫的最佳PEG-6000处理浓度为12.5%[20]。对于粳稻而言，成熟期不同，萌发期耐旱性筛选的适宜浓度也不同，翟荣荣等[8]认为25% PEG-6000是浙江晚粳稻芽期耐旱性筛选的适宜浓度；袁杰等[9]认为，新疆早粳稻萌发期耐旱性筛选的适宜浓度为20%，而田又升等[7]认为适宜浓度为15%。本研究利用不同浓度PEG-6000模拟干旱胁迫6份粳稻种质资源，发现5% PEG-6000严重抑制旱敏感种质和耐旱种质种子萌发的影响差异不显著，10% PEG-6000对两种不同类型种质种子萌发的影响不一致，20% PEG-6000严重抑制旱敏感种质种子萌发，无法对比鉴定不同类型种质，15% PEG-6000能够明显区分种子萌发期不同粳稻种质耐旱性差异。因此，本研究认为15% PEG-6000可作为筛选鉴定种子萌发期粳稻种质资源耐旱性的最适浓度，这与田又升等[7]的研究结论一致。

3.2 种子萌发期粳稻种质耐旱性鉴定指标的选择

萌发期、苗期和孕穗期是水稻生长中最为敏感的3个时期，萌发期是水稻群体数量建成的关键时期, 易受干旱胁迫的影响[21-22]。由于萌发期耐旱性鉴定具有胁迫用时短、易于重复、试验条件稳定、适合大批量材料鉴定等优点，因而用PEG-6000模拟干旱条件进行萌发期耐旱性鉴定较为适宜。前人针对水稻、糜子、绿豆、豌豆等不同作物萌发期耐旱性鉴定与评价开展了大量的研究，常选用发芽率、根长、芽长、萌发耐旱指数、活力指数等指标或相对值作为耐旱关键指标[23-26]。对水稻，不同研究者所选用的耐旱鉴定指标不同，李其勇等[6]采用储藏物质转化率作为耐旱鉴定一级指标，活力指数为耐旱鉴定二级指标；杨瑰丽等[27]选择芽鞘长和最长根长2个指标、王贺正等[5]选用相对芽长和相对芽干重2个指标分别作为耐旱性鉴定指标；翟荣荣等[8]和袁杰等[9]认为相对发芽率、相对芽长和相对根长是耐旱鉴定的3个关键指标，田又升等[7]选择了胚芽干重、发芽率、胚芽鞘长和根冠比为耐旱鉴定4个指标；敬礼恒等[10]在水稻萌发期耐旱鉴定中选用了更多的耐旱指标，包括相对发芽率、相对芽长、相对根长、相对根芽干重和种子萌发耐旱指数等。本研究在8个耐旱相关指标的基础上，通过主成分分析法确定了相对发芽势、相对芽长、活力指数、萌发耐旱指数4个指标作为耐旱鉴定关键指标，适合大量种质萌发期耐旱性鉴定，这与李其勇等[6]的研究结论较一致。

3.3 种子萌发期粳稻种质资源耐旱性综合评价

耐旱性是一个复杂的数量性状，仅利用单项耐旱指标评价种子萌发期水稻种质资源耐旱性存在局限性[28]，宜采用多项指标对不同种质的耐旱性进行综合评价，从而保证结果的准确性和科学性[29]。在多数研究中，由于相对发芽势、相对发芽率、相对芽长、发芽指数、活力指数等生长指标能够比较全面地反映出种质的萌发及生长状态，因而在作物萌发期耐旱性综合评价中被广泛采用[30-32]。本研究选用相对发芽势、相对发芽率、相对根长、相对芽长、相对根芽干重、相对根芽鲜重、萌发耐旱指数和活力指数8个指标进行测定。发现8个指标两两之间均存在极显著相关性，在此基础上利用主成分分析将8个指标转化为4个彼此独立的新指标，结合隶属函数值与权重的乘积并累加得到各种质耐旱性的综合评价D值，利用该指标将139份粳稻种质资源划分为耐旱、中等耐旱和旱敏感3种类型，准确地评价了这些资源的耐旱性，这与赵愉风等[33]对豌豆耐旱性评价结果相似。聚类分析是根据变量的数值特征变化对研究对象进行分类的一种多元统计分析方法，具有较高的可靠性[34]。本研究在耐旱性综合评价的基础上，以相对发芽势、相对芽长、萌发耐旱指数和活力指数4个关键指标数值为依据进行聚类分析，以D值作为参考，将139份粳稻种质材料分成4个亚群。其中，亚群Ⅰ为典型旱敏感亚群，亚群Ⅱ为耐旱亚群，亚群Ⅲ被视为旱敏感亚群(除6份中等耐旱种质外)，亚群Ⅳ被视为中等耐旱亚群。从聚类图(图1)中可以清楚地看出，活力指数与D值表现出较好的一致性，说明在种质资源聚类分析时，4个耐旱关键指标中的活力指数起着关键作用，与前人研究结果一致[35-38]。

3.4 粳稻耐旱种质资源的挖掘与利用策略

水稻育种的重要物质基础是种质资源，由于不同的地理、生态环境以及长期的种植制度等因素，形成了遍布全球的不同类型种质资源。水稻种质资源中蕴藏着丰富的自然变异，筛选水稻耐旱种质资源有望挖掘耐旱基因，为培育耐旱品种提供基因资源。Vivek等[39]利用分子标记对不同籼稻品种进行遗传多样性分析，发现在不同品种间存在着广泛的耐旱优异等位变异，进而筛选鉴定出Norungan和TK-M1 2个耐旱品系。Yusaku等[40]从菲律宾干旱高地品种KinandangPatong中获得了一个深根基因DRO1，将其导入到水稻栽培品种IR64中，培育出具有明显耐旱性的Dro1转基因水稻。Vanniarajan等[41]利用简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)标记对印度地方品种、籼稻和粳稻进行了遗传多样性分析，发现很多耐旱的有利等位变异多分布在粳稻品种和地方品种中。本研究从139份粳稻种质资源中均鉴定出耐旱性强的地方品种，如Farry、Hangarlan No.1、Bertone、Galhardo和Daniela，这些种质资源中均可能蕴藏着耐旱性状相关的优异等位变异，但仍需要进一步挖掘，其相应的耐旱分子标记的开发与利用也有待深入研究。

与其他稻作区相比，西北干燥区单季稻作区具有光热充沛、昼夜温差大和气候干燥等优势条件，使该区域生产的稻米高产优质具有较好的市场前景，但现今水资源供给不足已明显地限制了西北早粳稻生产的规模。本研究筛选鉴定到耐旱种质宁粳36号和2012-441，中等耐旱种质宁粳50号、宁粳51号、宁粳53号、宁粳39号和08GM38，其均为近年来新育成品种(系)，表现出较优的丰产性和稳产性；宁粳36号和宁粳50号还表现出品质优良的特性，分别达到国家1级和2级标准[42]，宁粳51号和宁粳53号的生育期还表现出中早熟性状[43]。因而，在适应现阶段西北干燥区种植业结构调整和发展节水农业的大背景下，建议以这些耐旱品种为育种亲本材料，培育多耐高产优质的早粳稻聚合体，研发适于干燥气候条件下的早粳稻直播技术，以保证西北干燥区稻谷的产量稳定。

4 结论

本研究表明模拟干旱胁迫(PEG-6000)的最佳浓度为15%，利用8个耐旱指标综合评价了种子萌发期粳稻种质资源，确定了相对发芽势、相对芽长、活力指数、萌发耐旱指数为4个关键指标，采用D值结合聚类分析，将139份粳稻种质资源划分为耐旱种质(0.698