阿霉素联合腺嘌呤诱导大鼠病理性衰老模型的建立

张华琴 万凤 唐玥雯 杨汝春* 王洲婷

慢性肾病（chronic kidney disease，CKD）发病率逐年增高，全球已有超过7亿慢性肾病患者，死亡人数达120万。我国以1.323亿患者成为全球CKD患者最多的国家。因此，CKD可能也是引起病理性早衰的重要原因。模拟人类肾脏疾病的实验动物模型对阐明机制及防治的研究具有重要意义，但目前肾脏损伤伴随衰老的模型尚无报道。阿霉素和腺嘌呤分别通过诱导肾小球或肾小管损伤诱导肾脏损伤[1］，但两者联合对肾功能、肾病理及肾组织衰老的诱导作用研究较少。本研究观察阿霉素与腺嘌呤联合诱导大鼠肾损伤和肾衰老的作用。

1 材料与方法

1.1 动物 无特定病原菌雄性SD大鼠24只，体重115.7±4.7 g，购自浙江省医学科学院实验动物中心。1.2 主要试剂 D-半乳糖（源叶，S11050），阿霉素（浙江海正药业股份有限公司，批号：040505），腺嘌呤（索莱宝，A8330），丙二醛（Malonic dialdehyde，MDA）试剂盒（碧云天，S0131S），兔抗p16INK4α多克隆抗体（碧云天，AF647），鼠抗GAPDH（ProteinTech，60,004-1-Ig），辣根过氧化物酶标记抗鼠、抗兔及抗羊IgG（H+L）、ABC（链霉素-卵白素）免疫组化检测试剂盒（均购自北京中杉生物技术公司）；β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal）试剂盒（碧云天，C0602）。

1.3 方法 （1）大鼠造模与实验分组：将大鼠随机分为正常对照（NC）组6只和不同造模组各8只，D-半乳糖组（D组）腹腔注射D-半乳糖100 mg/（kg·d）；阿霉素+腺嘌呤组（A+X组）尾静脉注射阿霉素5 mg/kg，3周后灌胃腺嘌呤100 mg/（kg·d）4周。模型组与正常对照组大鼠均常规饲养。（2）检测指标与方法：实验结束前在代谢笼中代谢，收集24 h尿，测量尿量，测定尿蛋白，计算24 h尿蛋白（urinary protein，UP）。试验结束时称取体重，腹主动脉取血，检测血肌酐。取肾脏，称取单肾重，计算肾重与体重指数。去肾包膜，取部分肾组织用于检测MDA水平，用蛋白含量进行校正；部分肾组织4%多聚甲醛固定，行苏木精-伊红染色（HE）和Masson染色，观察肾脏组织病理损伤和纤维化，采用ImagePro plus6.0图像分析；免疫组化检测肾组织p16INK4α蛋白原位表达；肾组织冷冻切片检测SA-β-GAL活性；戊二醛固定肾组织，进行透射电镜检查，观察肾组织超微观病理改变。

1.4 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件。计量资料用（±s）表示，多组间比较采用one-way ANOVA，组间两两比较用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体重、肾重以及肾重/体重比较 大鼠从造模到试验结束共8周，D组实验期间死亡1只，A+X组死亡2只。与NC组比较，D组和A+X组大鼠体重和肾重/体重指数均显著增高，A+X组肾重/体重指数高于D组；A+X组肾重高于NC组和D组。见表1。

表1 各组大鼠体重、肾重以及单肾/体重指数比较（±s）

表1 各组大鼠体重、肾重以及单肾/体重指数比较（±s）

注：与NC组比较，*P＜0.05；与D组比较，#P＜0.05

组别 n 体重（g） 肾重（g） 肾重/体重×100 NC组 6 343.5±37.6 1.11±0.08 3.25±0.27 D组 7 261.4±60.4* 1.03±0.18 4.02±0.57*A+X组 6 283.3±25.0* 1.42±0.20*# 5.03±0.77*#F值 5.69 10.01 14.40 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 各组大鼠尿蛋白、血肌酐水平比较 A+X组血肌酐水平高于NC组和D组差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠尿蛋白、血肌酐水平比较（±s）

表2 各组大鼠尿蛋白、血肌酐水平比较（±s）

注：与NC组和D组比较，*P＜0.05

组别 n 24 h尿蛋白（g/μmoL） 血肌酐（μmol/L）NC组 6 6.39±1.41 31.90±1.95 D组 7 5.43±1.10 31.93±3.72 A+X组 6 23.29±17.35 41.35±8.03*F值 6.10 7.27 P值 ＞0.05 ＜0.05

2.3 大鼠肾组织病理改变 NC组大鼠肾组织切片光镜下可见肾小管上皮细胞形态正常、排列整齐，肾小球结构清晰，毛细血管襻开放良好；D组与NC组相似；A+X组大鼠肾组织可见明显的肾间质炎性细胞浸润，有不同程度的间质纤维化，肾小管管腔扩张，部分管腔内有蛋白管型，肾小球系膜基质增生并呈弥漫性分布。A+X组总纤维化和肾小球硬化高于NC组和D组。见表3和图1～2。

表3 肾小管间质和肾小球总纤维化半定量分析比较（±s）

表3 肾小管间质和肾小球总纤维化半定量分析比较（±s）

注：与NC组和D组比较，*P＜0.05

组别 n 肾间质与肾小球总纤维化（OD） 肾小球硬化（OD）NC组 4 0.010±0.005 0.041±0.005 D组 4 0.016±0.006 0.043±0.008 A+X组 4 0.046±0.003* 0.074±0.009*F值 60.94 23.13 P值 ＜0.05 ＜0.05

图1 大鼠肾组织石蜡切片HE染色

图2 大鼠肾组织石蜡切片Masson染色

2.4 透射电镜观察大鼠肾小球超微观结构 透射电镜下NC组肾小球基底膜厚薄均匀，界限清楚，足细胞足突排列整齐，内皮细胞窗孔清晰；D组与NC组相似；A+X组肾小球基底膜部分增厚，界限不清，足细胞足突轻中度融合，内皮细胞窗孔部分消失。见图3。

图3 透射电镜观察各实验组肾小球足细胞（×5,000）

2.5 大鼠肾组织SA-β-Gal及MDA比较 D组和A+X组肾组织MDA水平比NC组增高；D组和A+X组肾组织SA-β-Gal活性均高于NC组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4和图4。

图4 β-半乳糖苷酶活性检测

表4 各组大鼠肾组织SA-β-Gal及MDA比较

2.6 免疫组化技术检测大鼠肾组织p16INK4α蛋白原位表达水平比较 NC组大鼠肾组织p16INK4α在肾小管刷状缘呈阳性表达，肾小管及肾小球p16INK4α阳性染色较弱；D组与A+X组大鼠肾组织中除肾小管刷状缘外，肾小管及肾小球p16INK4α阳性染色均明显增强，A+X组肾小球阳性染色增强。D组与A+X组大鼠肾间质及肾小球总p16INK4α积分光密度（IOD）均比NC组增强，A+X组肾小球p16INK4α比D组增强。见表5和图5。

表5 各实验组大鼠肾间质及肾小球总p16INK4α半定量分析[IOD，（±s）］

表5 各实验组大鼠肾间质及肾小球总p16INK4α半定量分析[IOD，（±s）］

注：与NC组比较，*P＜0.05；与D组比较，#P＜0.05

组别 n 肾间质+肾小球总p16INK4α 肾小球p16INK4α NC组 4 137,783±22,771 3,513±665 D组 4 260,429±21,348* 13,964±3,881*A+X组 4 277,780±36,019* 30,421±4,690*#F值 30.76 27.3 P值 ＜0.05 ＜0.05

图5 免疫组化技术检测各组p16INK4α表达

3 讨论

CKD可能是导致人体早衰的重要病理原因。有研究显示，CKD患者存在着认知减退现象，肾小球滤过率严重下降与进展性的认知恶化密切相关[2］。CKD还会导致矿物骨病，并引起血管钙化[3］。CKD患者性激素水平及性功能均随肾小球滤过率降低而明显下降，并影响正常生活[4］。CKD患者甲状腺功能及促甲状腺激素水平也受到影响，导致钙磷等代谢紊乱[5］。

阿霉素可引起肾小球滤过膜通透性增加，破坏肾小球滤过膜的结构和功能[6］。阿霉素肾病模型主要表现为蛋白尿、足细胞损害、高血脂的肾病综合征，随着病情的发展出现肾小球硬化、肾脏纤维化，严重可导致肾功能衰竭。腺嘌呤诱导慢性肾功能衰竭大鼠模型主要是通过腺嘌呤引起肾小管梗阻，肾单位大量丧失，导致氮质血症，毒素蓄积及电解质和氨基酸代谢紊乱，进而引起肾功能衰竭[7］。

本研究结果显示，D组和A+X组大鼠肾重/体重指数均增高，提示两组肾脏均发生病理改变；其中阿霉素联合腺嘌呤组血肌酐水平增高，大鼠肾病理可见明显的炎细胞浸润和间质纤维化及足细胞出现轻中度融合，SA-β-GAL活性及p16INK4α表达增高，且肾小球p16INK4α表达水平较NC组和D-半乳糖组增高。D-半乳糖对大鼠血肌酐水平及肾脏病理损伤影响不明显，但可增高肾组织MDA水平、SA-β-GAL活性与p16INK4α蛋白表达水平。D-半乳糖可增加肾组织MDA和SAβ-GAL活性方面，与以往文献报道一致[8］。在前期研究中亦发现，2型糖尿病肾病患者中衰老标志分子SAβ-GAL和细胞周期抑制蛋白p16INK4α在肾小球和肾小管中表达均增加，提示肾脏疾病中存在细胞衰老现象[9］。p16INK4α基因是一种新型抗癌基因，在衰老的进程中发挥重要作用。FAMULSKI等[10］研究发现硬化肾小球的数量、间质纤维化及肾小管萎缩均与p16INK4α基因表达相关。总之，阿霉素联合腺嘌呤可诱导CKD致病理性衰老模型。