益气活血通脉颗粒调控小胶质细胞介导脑缺血再灌注损伤的作用机制

汤俏璐 段莉琴 严民力*

缺血性脑卒中具有高致残率、高病死率，其有效治疗仍然是目前临床上的难点[1］。缺血性脑卒中发生血液再灌注可导致脑缺血再灌注损伤[2］，其形成的过程涉及到氧化应激反应、炎症反应等[3］。在病理或正常环境下，中枢神经系统中小胶质细胞可以被激活并释放抗炎因子、神经调节因子，清除有害物质，并指引干细胞向炎症灶迁移，促进神经元的再生和存活[4-6］。同时也可以释放出多种炎症因子，引起炎症反应，损害脑组织[7］。有研究表明益气活血通脉颗粒可有效改善脑缺血再灌注模型大鼠颞叶神经元损伤[8］。本文探讨益气活血通脉颗粒通过调控小胶质细胞介导脑缺血再灌注损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞 SPF级雄性SD大鼠，24只，6～8周龄，由上海斯莱克实验动物有限责任公司所提供，许可证号：SCXK（沪）2017-0015，动物合格证号：20170005024850，大鼠的饲养来源主要为杭州鹰旸生物科技有限公司。BV2小胶质细胞[iCell-m011，赛百慷（上海）生物技术股份有限公司）］。

1.2 药物与试剂 DMEN培养基（批号：SH30243.01，Hyclone）；96孔 培 养 板（批 号：167008，Thermo）；0.22μm滤膜（批号：R7EA15981，MILLEX-GP）；小鼠活性氧簇（ROS）ELISA检测试剂盒（批号：JL20383，上海江莱生物科技有限公司）；小鼠白细胞介素1β ELISA试剂盒（批号：MM-0040M1，江苏酶免实业有限公司）；小鼠白细胞介素18 ELISA试剂盒（批号：MM-0169M1，江苏酶免实业有限公司）。

1.3 实验器材 酶标仪（型号：CMaxPlus，MD）；低温高速离心机（型号：Micro17R，Thermo）；细胞培养箱（型号：BB150，Termo）。

1.4 实验方法 （1）细胞培养：培养实验用BV2小胶质细胞，使用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行相关的培养工作，所使用培养箱的温度设置为37℃，二氧化碳含量为5%，每隔2～3 d进行传代。（2）益气活血通脉颗粒和含药血清配方：甘草5 g，红景天6 g，大枣6枚，生姜6 g，水蛭6 g，当归10 g，赤芍10 g，桂枝10 g，益母草10 g，黄芪30 g，做成中药颗粒剂，5 g/袋，每袋相当于12 g生药。按体重将SD大鼠随机分为空白对照组和中药组，分别以0.9%氯化钠溶液和中药（8 g/kg）灌胃。每天8∶00及16∶00各灌胃1次，连续7d，最后一次灌胃后1 h，于腹主动脉中取出血液，进行离心分离血清，过滤后，-20℃冷冻待用。（3）BV2小胶质细胞氧糖剥夺/复氧模型的建立：此次实验所用细胞的生长周期为对数生长期，将原培养板中的培养基弃去，用无添加糖的DMEM培养基代替，置于氧糖剥夺罐中孵育6 h，其间不断补进5% CO2及95% N2混合气体，将流量维持在2 L/min；随后将培养板转移出来，原培养液按实验守则丢弃，另外添进新的DMEM/F12培养基，培养箱温度设置为37℃，CO2含量为5%，继续培养以达到复氧复糖的目的。（4）分组及干预：细胞分成4组，空白组、OGDR模型组、空白血清组、含药血清组。除空白组外，其余三组均置于氧糖剥夺罐进行氧糖剥夺/复氧实验。（5）BV2小胶质细胞培养后，800 r/min离心10 min，收集上清液，使用0.22μm微孔滤膜隔离滤液，过滤后所得的溶液置于冰箱-40℃进行储存，检测细胞上清中ROS、IL-18、IL-1β水平；①前期准备：将在冰箱里保存的试剂盒拿出，室内复温20 min。配液：将20×洗涤液通过蒸馏水稀释成原倍数的洗涤液；②加标准品和待测样本：在框架上置放好所需酶标板，孔数分为3组，标准品组、待测样本组及空白对照组，首先在标准品组添加50 μL标准品；待测样本组添加10 μL待测样本，继续在待测样本组添加40 μL样本稀释液；空白对照组无添加；③分别添加100μL的辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体进入标准品组和待测样本组。④温育：将反应孔封住，封膜用刮刀刮紧，以防漏液，置于水温为37℃的水浴锅中，或温度为37℃的恒温箱中温育60 min；⑤洗板：弃液后用吸水纸拍干板子，然后在孔里注满洗涤液，置于室内1 min，弃液后用吸水纸拍干，按步骤重复5次；⑥显色：将50 μL显色剂A溶液添加到每个孔中，然后添加50 μL显色剂B溶液，可以应用平板混匀器使其得到充分混匀，时间30 s（也可以手动进行震荡混匀，力度不能太大，时间30 s），避光置放于37 ℃的环境中显色15 min；⑦终止：酶标板的每个孔均添加50 μL终止液，使反应不再继续；⑧测定：用空白孔进行反应调零，反应停止后15 min内，通过450 nm波长分析每个孔的吸光值（OD值），实验重复6次；⑨ELISA检测：取各组细胞上清液，应用ELISA试剂盒检测各组细胞中ROS、IL-1β、IL-18水平。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件。符合正态分布计量资料以（±s）表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较用SNK检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小胶质细胞中ROS水平比较 与空白组比较，OGDR模型组与空白血清组小胶质细胞中ROS水平升高（P＜0.01），与空白血清组比较，含药血清组小胶质细胞中ROS水平降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小胶质细胞中ROS水平比较[ng/L，（±s）］

表1 各组小胶质细胞中ROS水平比较[ng/L，（±s）］

注：与空白组比较，*P＜0.01；与空白血清组比较，#P＜0.05

组别 ROS空白组 374.11±33.73 OGDR模型组 458.8±27.50*空白血清组 471.26±33.18*含药血清组 413.42±26.32#

2.2 各组小胶质细胞中IL-1β和IL-18水平比较 与空白组比较，OGDR模型组与空白血清组小胶质细胞中IL-1β和IL-18水平升高（P＜0.01），与空白血清组比较，含药血清组小胶质细胞中IL-1β和IL-18水平降低（P＜0.01）。见表2。

表2 小胶质细胞中IL-1β和IL-18含量水平变化情况[pg/mL，（±s）］

表2 小胶质细胞中IL-1β和IL-18含量水平变化情况[pg/mL，（±s）］

注：与空白组比较，*P＜0.01；与空白血清组比较，#P＜0.01

组别 IL-1β IL-18空白组 42.45±4.39 18.88±2.34 OGDR模型组 105.98±12.22* 65.86±6.19*空白血清组 101.8±17.43* 66.73±9.16*含药血清组 67.01±4.79* 38.66±4.69#

3 讨论

缺血性脑卒中再灌注损伤病因与分子机制，包含氧化应激、炎症、能量代谢损伤、谷氨酸盐/神经毒性物质的释放、钙超载、凋亡及自噬过程[3］。中医学将缺血性脑卒中归类为中风，风滞、痰、火气、癖、毒是形成缺血性脑卒中的病因。治疗方法有活血益气、祛除癖血、畅通血脉、提神醒脑、止咳化痰、通便、补肾补益气等，临床上应用中成药、针灸与健康治疗等方法，能明显改善脑卒中患者的后遗症与脑神经的恢复[9-10］。《医林改错》记录的补阳还五汤剂是现代益气活血通脉颗粒的由来，其功效是通气、活血化癖、通脉络、提神醒脑，在临床应用中获得较好的治疗效果。

研究表明，缺血性脑卒中发病过程中，一旦出现炎症反应，可引起脑神经衰亡、血脑屏障受损并且加重脑水肿等情况[11］，因此，为了防止炎症造成二次脑组织伤害，治疗炎性损伤已成为缺血性脑卒中预后的研究方向。小胶质细胞在炎症治疗过程中有重要作用，作为中枢神经系统吞噬细胞的小胶质细胞，其大致分为两种状态M1型与M2型，两种极化状态有促炎与抗炎两种作用[4］。M1型状态为细胞免疫应答，会产生多种炎症介质和细胞毒性物质（ROS、TNF-α、IL-1、iNOS等），进而造成细胞组织损伤；M2型细胞加速细胞繁殖，产生神经营养因子和抗炎症因子（BDNF、IL-10、IL-4、TGF-β等），能够修复受损组织细胞[12］。缺血缺氧可使小胶质细胞高表达基质金属蛋白酶-9，继而活化、水解基膜蛋白，破坏血脑屏障、加剧中性粒细胞浸润、诱导小胶质极化引发神经炎性反应和神经元损伤，使梗死面积不断扩大[13］。

本研究结果显示，与空白组比较，OGDR模型组与空白血清组小胶质细胞中ROS水平升高（P＜0.01），与空白血清组比较，含药血清组小胶质细胞中ROS水平降低（P＜0.05）。表明益气活血通脉颗粒可以减弱缺氧复氧导致的小胶质细胞氧化应激反应，保护脑组织。Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体大多数在小胶质细胞里，如感受到内源的危险刺激信号，NLRP3炎症小体会有所反应，从而产生促炎细胞分子，如IL-1β和IL-18，从而加重脑缺血后的炎症反应[14-15］。本研究结果显示，益气活血通脉颗粒可以降低小胶质细胞IL-1β、IL-18水平。表明，益气活血通脉颗粒可以减弱缺氧复氧导致的小胶质细胞炎症反应和炎性损伤。

综上所述，益气活血通脉颗粒可能通过调节小胶质细胞NLRP3炎症小体，从而降低ROS及IL-1β、IL-18的分泌，进一步减弱缺氧复氧导致的小胶质细胞氧化应激反应及抵抗缺氧复氧导致的小胶质细胞炎性反应，改善缺血性脑卒中患者的预后。