植物蛋白与天然双亲皂苷相互作用及对食品乳液和泡沫的稳态化研究进展

陈小威，尹文俊，马传国

（河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001）

日常生活中，许多天然及加工食品是由界面存在并主导形成的多相分散体系，如牛奶、奶油、蛋黄酱、沙拉酱和乳饮料等乳液食品以及慕斯、冰淇淋、啤酒等泡沫食品。这些多相体系因气泡和油滴等结构单元的存在而具有高比表面积，其一系列宏观行为（形成、稳定和功能等）很大程度上取决于两相界面（气-水界面、油-水界面）性质，因此这些食品被认为是“界面主导食品”。这些多相态的界面主导食品因其独特的结构而能提供特有的质地，且因具有包埋和运载活性物质的特性而被用于开发健康食品。但是，由于高比表面积和表面自由能的存在，这些界面主导食品本质上属于热力学不稳定体系。

以植物原料制备的食品因在营养、绿色环保和健康方面的优势备受消费者青睐，尤其是植物蛋白基食品，如植物肉、植物奶和植物冰淇淋等。然而，植物蛋白在构建泡沫和乳液等界面主导食品方面的能力差，且在贮存过程中易发生聚集、絮凝和分层而失稳。此外，以植物蛋白为代表的生物大分子对环境具有较高的敏感性，使其在食品工业中的应用仍然具有一定挑战，例如酸碱度、温度和离子强度等都会造成生物大分子构象的改变，从而导致界面不稳定甚至崩塌。以植物为主要原料制备的高稳态复杂食品（如豆浆、啤酒）更多地是通过添加小分子表面活性物质形成植物蛋白-小分子表面活性剂复合物从而提高植物蛋白基界面主导食品的稳定性。传统的研究聚焦于用合成或半合成小分子（十二烷基硫酸钠、吐温和司盘等）与蛋白质实现界面主导食品的稳定。近年来，食品工业致力于探寻天然表面活性物质以替代合成及半合成类小分子表面活性剂，植物来源的天然双亲性皂苷，如皂皮皂苷（saponin，QS）、茶皂苷（tea saponin，TS）、甜菊糖苷（stevioside，STE）、甘草酸苷、田七皂苷、人参皂苷、柚皮苷等成为首选。这些皂苷分子从植物中提取获得，具有由疏水性苷元和亲水糖侧链组成的双亲结构，不仅具有能与人工合成表面活性剂相媲美的界面活性，还有多种生物活性（降胆固醇、提高免疫力和抗氧化等）。其中，以QS为代表的天然皂苷已被美国食品药品管理局（21 CFR 172.5）、欧洲共同体（E999）和日本、澳大利亚（FSANZ-144）、新西兰、加拿大以及中国（FEMA-2793）批准在食品、药品和日化品中应用。研究证明，通过天然双亲皂苷能有效地改善蛋白基泡沫和乳液等界面主导食品的稳定性，且在功能因子（姜黄素和植物甾醇等）荷载、新型植物基食品体系的构建等方面具有积极意义。本文主要概述植物蛋白与天然皂苷间存在的相互作用及其界面吸附与稳定行为，进而从分子与宏观层面分析泡沫和乳液构建与稳定的关系，以期为植物蛋白基食品的稳态化构建以及植物基食品功能因子递送载体的构建提供理论支撑与技术指导。

1 植物蛋白与天然双亲皂苷的相互作用

植物蛋白与天然双亲皂苷之间主要存在疏水相互作用、氢键以及静电相互作用。皂苷作为非离子型小分子表面活性剂，常被认为不能解离出带电离子而不会与蛋白质发生静电相互作用。目前经多种技术手段（如电位和分子对接等）证实，人参皂苷Rg、Rb和Ro与牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）存在静电相互作用。李红等通过分子对接技术发现，人参皂苷不仅与血清蛋白间发生静电相互作用，还具有氢键和疏水相互作用。而大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）与STE、小麦醇溶蛋白与TS、低温热变性豌豆蛋白与QS均可通过疏水相互作用结合。表1总结了部分蛋白质与皂苷相互作用的研究，这些研究证实了蛋白质与皂苷间相互作用的形式不是唯一的，分子常以多种弱作用力形式相互联结形成稳定的复合物。图1为植物蛋白与天然双亲皂苷相互作用示意图。多种作用力存在的情况下，体系中主要分为两种结合形式：一种是植物蛋白直接与双亲皂苷连接，通过疏水相互作用（植物蛋白疏水空腔包裹皂苷的疏水苷元）、氢键相互作用（植物蛋白部分亲水性氨基和皂苷亲水糖侧链结合）和静电相互作用（所带异性电荷相吸）结合；另一种是在外界环境的刺激下，植物蛋白内部的键被削弱而发生结构变化，之后再与双亲皂苷结合。结构展开的植物蛋白与皂苷产生更强的相互作用（疏水相互作用、氢键和静电相互作用），使更多的皂苷与植物蛋白结合。此外，高浓度的天然植物蛋白和热处理后的变性植物蛋白均易以蛋白-蛋白相互作用的形式存在，而皂苷在超过临界胶束浓度（critical micelle concentration，CMC）后易形成胶束，这些分子的多形态化促使在发生相互作用（疏水、氢键和静电相互作用）后可形成复杂的复合物。不同结构蛋白质可以选择性地识别皂苷分子的羟基（如溶菌酶）或羧基（如-乳球蛋白（-lactoglobulin，-LG））部分，通过特殊的方式调节皂苷与蛋白质的相互作用，可为控制界面膜的机械性能开辟新途径。

表1 部分蛋白质与皂苷相互作用研究Table 1 Summary of selected studies on interactions between proteins and saponins

图1 植物蛋白与天然双亲皂苷相互作用的示意图Fig. 1 Schematic diagram of interactions between plant proteins and saponins

通过多种作用力形成的植物蛋白与天然双亲皂苷复合物，相对于单一物质而言，其结构和性质均会产生不同程度的改变。一方面，皂苷可被用于调控蛋白质的结构。仅用简单的改性手段设计蛋白质结构来改善其功能性质已不能满足需求，而利用皂苷和蛋白质相互作用已成为优化蛋白质结构的有效途径。例如，在浓度低于CMC时，皂苷与蛋白质的疏水结合一般不会显著影响蛋白质的结构，但当浓度高于CMC时，皂苷形成的胶束能使蛋白质发生明显的去折叠；另一方面，蛋白质与皂苷的结合会促进部分功能活性的提升。Potter等通过动物实验研究发现，向酪蛋白中添加皂苷会导致低密度脂蛋白/高密度脂蛋白比值显著降低。

2 植物蛋白与天然双亲皂苷在界面的吸附行为

不同乳化剂界面吸附行为决定其降低界面张力的能力、形成的界面膜黏弹性、膜厚度和致密性，进而影响相关体系的宏观性质，如乳液和泡沫的稳定性和流变学特性。因此，研究乳化剂在界面的吸附行为对稳定体系的构建十分重要。目前常采用两个模型来模拟蛋白质吸附到界面的过程，第一个模型是Graham等提出的“环链模型”（图2A）。它描述了一个多步骤过程，涉及蛋白质从体相扩散到界面，然后进行吸附和构象展开。在这种模型下，蛋白质通常被看作是柔性聚合物链，到达界面后疏水部分定向到气相（链），亲水部分延伸到水相（环），最后形成“环链”结构。不同的是，Wierenga等提出第二种“胶体模型”（图2B），其认为蛋白质在界面处表现为带电球体或多个带电球体的组合，在吸附时保留其天然构象。外吸附层可作为带电粒子的填充层，随着静电斥力的增强（表面电荷增加），外吸附层加厚，相互作用变强，球体间距变远。在界面吸附诱导过程中，植物蛋白分子结构变化以及分子间的相互作用（静电相互作用和空间位阴）使其在气-水界面上形成类似凝胶的界面网络结构的蛋白吸附膜。在油-水界面，植物蛋白分子则会重新定向排列以减少热力学阴碍、降低界面张力，从而形成3D网络结构。但植物蛋白到达界面速度慢、稳定界面膜刚性特征强和对环境敏感性高的特点使得泡沫和乳液形成能力差且易失稳。波兰Wojciechowski教授团队研究发现，通过添加天然双亲性皂苷（如七叶皂苷、TS、QS等）可解决蛋白质稳定性差的难题。这是因为皂苷分子结构和平均界面面积的差异使其能够以顶端排列、侧端排列和平铺排列的不同方式，在分子间疏水相互作用和糖基间氢键作用下，于气-水界面上形成比植物蛋白更致密的高黏弹性界面膜（图2C）。而带有不同苷元和糖基的皂苷分子在界面的吸附形态和相互作用程度不同，如单糖侧链的七叶皂苷和TS，TS吸附层的疏水部分由垂直于表面并完全暴露于气相的三萜类骨架组成；七叶皂苷由于三萜部分存在羟基使得亲水结构仅部分浸入水相，疏水苷元外层在空气中堆积不紧密。对于双糖侧链皂苷，当亲水糖侧链大小不一时（如人参皂苷），常导致大亲水糖侧链基团插入水相而疏水苷元与小亲水糖侧链共同趋向于疏水气相；当亲水糖侧链大小相似时（如QS），则导致糖侧链基团均插入水相而疏水皂苷趋向于疏水气相。因此，天然双亲皂苷的吸附效果主要是由氢键作用后紧密堆积的糖侧链基团控制。到达界面后，天然皂苷分子会定向排列并出现某种特异组装行为，形成坚固的褶皱膜，在宏观上表现出纤维状、片状、囊泡状等组装形貌（图2D），如甘草酸分子自组装形成纤维，通过多层纤丝膜（在气-水界面）和氢键纤丝网络（在气泡表面和连续相中）稳定泡沫。当加入油相乳化形成乳液后，纤维间相互作用（氢键）产生的多层界面结构能有效抗絮凝和聚结。本课题组前期研究证实，QS同样能在油-水界面上自组装，通过皂苷分子间π-π堆积和氢键结合螺旋扭曲形成纳米纤维组装体，在分散油滴表面形成多层膜，提高乳液稳定性。与植物蛋白不同的是，当皂苷达到一定浓度且体系中油相含量比较高时，这些结构单元才能自组装形成3D网络结构，使乳滴固定，进而构建成乳液凝胶。

图2 蛋白在界面的吸附机制和皂苷在界面的吸附行为[23-24,28,32]Fig. 2 Adsorption mechanism of proteins at the interface and adsorption behavior of saponins at the interface[23-24,28,32]

植物蛋白与天然双亲皂苷在稳定油-水或气-水界面时均可以吸附到界面上并能降低界面张力，但二者降低界面张力的能力和效率以及对吸附层的稳定特性并不相同。目前的研究将蛋白质与小分子共存时的界面吸附机制分为3 种（图3）：协同作用、竞争吸附和分子置换。早期英国著名的胶体界面化学家Dickinson教授对乳蛋白-小分子表面活性剂混合体系的吸附特性进行了大量的研究和总结，认为蛋白质-小分子表面活性剂复合体系界面吸附行为更倾向于通过置换机理实现。具体而言，对于已形成的植物蛋白界面，当添加的小分子表面活性剂浓度达到一定量时，可将蛋白从界面上完全置换，最后形成小分子的特征界面膜。随着合成和半合成表面活性剂广泛的应用，学者们对蛋白质与十二烷基硫酸钠、吐温系列和司盘系列等合成和半合成小分子表面活性剂进行研究，通过界面张力和界面流变学行为对吸附过程进行表征，发现具有大亲水基团的吐温系列（如吐温20）在低浓度下易通过竞争吸附将蛋白质置换，而对于一些小亲水基团的非离子表面活性剂（如司盘80），在达到一定浓度后其与蛋白竞争的效果才显著。对于植物蛋白而言，其与天然双亲皂苷被认为主要是通过协同作用稳定界面。当植物蛋白与天然皂苷共同加入水相时，在较低皂苷浓度下，体系的界面吸附、扩张流变学行为是由蛋白主导；达到适宜皂苷浓度时，植物蛋白与天然皂苷分子通过非特异性疏水相互作用和氢键等发生弱的结合（图1），诱导蛋白分子部分解离及刚性结构松散，表现出独特的降低界面张力的协同性及稳态的界面弹性行为，此时的复合界面层具有一定刚性和柔性，能更好地响应外部压力，从而提高泡沫和乳液的稳定性；当大量皂苷存在时，体相中形成大量皂苷胶束，皂苷会先于蛋白-皂苷胶束复合体吸附到界面而形成主要由皂苷覆盖的弱表面层结构，此状态下的体系稳定性较弱，但皂苷形成胶束会使蛋白质发生去折叠，随着吸附时间的延长可形成更为稳定的界面膜。这样的植物蛋白与天然双亲皂苷协同稳定界面机制已被许多学者证明。

图3 植物蛋白与天然双亲皂苷的界面吸附机制示意图[39,42]Fig. 3 Schematic diagram of interfacial adsorption mechanism between plant proteins and saponins[39,42]

3 植物蛋白与天然双亲皂苷对泡沫和乳液的稳态化

为了更好地分析相互作用和界面吸附行为在界面主导食品形成能力和稳态化中的作用，需理解乳液和泡沫的多尺度结构特征。乳液和泡沫在不同尺度上具有不同的结构水平，如图4所示，从分子水平的体相行为、界面膜到宏观层面的乳滴与气泡以及最终的乳液和泡沫体系。食品是一种公认的软凝聚态物质，具有多组分、多相态、多结构尺度等属性。食品的功能特性是由食品多组分（蛋白质、碳水化合物、油脂及生物小分子）相互作用及由此形成的多相态（水相、油相、凝胶相）、多尺度（纳米、微米、毫米及厘米）结构决定的。在特定界面主导食品加工条件下，食品多组分可在三维体相通过分子间相互作用及自组装形成纳/微米尺度结构体，这些结构单元可在油-水、气-水等二维流体界面上经界面组装、界面交联等形成油滴、气泡等而最终装配成乳液、泡沫等宏观食品体系，从而决定食品的品质（稳定性、风味、颜色）、营养及功能性（营养素输送、饱和/反式脂肪替代）。由此可见，作为连接食品体系分子行为与宏观性质的桥梁，食品组分间的相互作用及纳微结构单元的设计与构建及其二维流体界面行为控制对于控制最终食品的品质与营养起到极为关键的作用。

图4 乳液（A）和泡沫（B）结构的多尺度特征示意图Fig. 4 Multi-scale characteristics of emulsion (A) and foam (B) structures

皂苷分子的添加可赋予植物蛋白基泡沫高黏弹性和稳定性。Böttcher等利用荧光技术和界面流变学等证实了-LG和QS可形成黏弹性界面网络，使体系具有高剪切和膨胀模量，进而提高泡沫稳定性和抗外力刺激能力。-LG和QS在体相中通过氢键、范德华力或疏水相互作用，以1.7 个结合位点数形成复合物，在气-水界面上形成多形态分子稳定的界面层，提高了泡沫的稳定性。值得注意的是，复合物实际吸附到界面上的量较少（界面张力增加）时会发生部分解吸，促使体相中的-LG和QS到达空缺界面而呈现竞争吸附。在适宜QS浓度下，-LG和QS可通过协同作用提高剪切黏弹性、液膜厚度和液体含量，实现泡沫的长期稳定。这样的协同效应在大豆11S蛋白和7S蛋白与大豆皂苷复合体系的起泡性和泡沫稳定性研究中也被证实。这些研究表明植物蛋白-天然皂苷基泡沫的稳态化机制会随着表面活性剂浓度的变化而调整。具体地，植物蛋白-皂苷复合体系可保留分子自身稳定泡沫的规律，但是皂苷的添加通过竞争吸附破坏植物蛋白吸附层，该情况下皂苷不再通过吉布斯-马朗戈尼机制维持界面，这使得复合体系界面张力不易平衡，泡沫的稳定性变弱。随着皂苷浓度的增加，它会逐渐代替界面上的蛋白分子，皂苷的强分子间相互作用使分子自排序而形成结构域，提高界面层的膨胀和剪切模量，因此泡沫体系的稳定性得到提高。当皂苷浓度一定时，植物蛋白与皂苷协同作用使界面表现出显著的强相互作用、低界面张力和高界面膨胀模量，从而实现泡沫稳定。同样地，添加皂苷在提高植物蛋白基乳液贮藏稳定性、氧化稳定性、环境稳定性等方面均效果显著（表2）。这样的稳定效果均归因于分子间发生相互作用，皂苷可改变植物蛋白的刚性结构，进而有效降低界面张力，形成具有高柔韧性的界面层。乳液的稳定机制和稳定性过程与泡沫体系类似。此外，通过荧光技术和界面流变学等分析结果能反映分子结合程度和界面组成的变化，为皂苷分子与蛋白质在体相中和界面上的作用过程提供关键信息，对稳定机制做出解释。

表2 蛋白质-皂苷复合稳定乳液Table 2 Emulsions stabilized by a synergistic interaction of proteins and saponins

4 结 语

通过添加天然双亲皂苷分子可改善植物蛋白基乳液和泡沫类界面主导食品的稳定性，但植物蛋白与皂苷分子在这些体系中的具体稳定机理相对复杂。研究证明，植物蛋白和天然皂苷在体相中和界面上主要以疏水相互作用、氢键和静电相互作用实现分子间紧密结合，但是不同分子吸附行为的差异和相互作用下分子形态的多样化使得它们能以协同作用、竞争吸附和分子置换等吸附机制稳定界面，最终实现泡沫和乳液等界面主导食品的稳态化。然而，在稳定机理的探究过程中仍存在疑点，如微观结构与宏观表现间的构效关系尚未明确。通过结合耗散型石英晶体微天平、界面流变和朗缪尔（Langmuir）膜天平等新技术进一步揭示植物蛋白与天然双亲皂苷在泡沫和乳液等界面主导食品中的稳态化规律以及在多尺度结构上的构效关系可能是该研究领域的一个突破点。作为多相态的体系，植物蛋白-天然双亲皂苷稳定的泡沫和乳液在食品功能因子递送方面存在天然的优势，然而目前该方面的相关研究较少。此外，双亲皂苷对蛋白基食品在口感、营养和安全方面的影响也应该被重视。