马铃薯晚疫病菌对霜脲氰抗性动态监测及药效验证

路粉，孟润杰，吴杰，赵建江，李洋，毕秋艳，韩秀英，李敬华，王文桥✉

1河北省农林科学院植物保护研究所/河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心/农业农村部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室，河北保定 071000；2保定职业技术学院，河北保定 071051；3滨州职业学院，山东滨州 256603

0 引言

【研究意义】由致病疫霉（）引起的晚疫病是马铃薯生产上的毁灭性病害之一，该病发生范围广、流行速度快，大流行时可造成马铃薯减产 20%—50%，严重制约马铃薯产业发展。我国对马铃薯晚疫病的防治主要依赖化学防治，抗药性的产生是马铃薯晚疫病化学防治中的重要问题。从20世纪 90年代初开始我国大量使用霜脲氰·代森锰锌防治马铃薯晚疫病，至今已有20余年历史。明确马铃薯晚疫病菌对霜脲氰（cymoxanil）的抗性动态和霜脲氰及其混剂的田间防治效果，分析晚疫病菌对霜脲氰的敏感性变化与其田间防治效果之间的关系，对晚疫病防治中合理选药用药具有重要意义。【前人研究进展】生产中主要采用抗病育种、化学防治和生物防治等措施防治马铃薯晚疫病。化学防治具有防治效果高、见效快等特点，常用药剂除了代森锰锌、百菌清、氟啶胺等非内吸性杀菌剂外，还有苯基酰胺类甲霜灵、精甲霜灵，苯甲酰胺类氟吡菌胺，乙酰基肟类霜脲氰，氨基甲酸酯类霜霉威，QoI类嘧菌酯、吡唑醚菌酯、噁唑菌酮，羧酸酰胺类烯酰吗啉、双炔酰菌胺、氟吗啉和哌啶基噻唑异噁唑啉类氟噻唑吡乙酮等多种内吸性杀菌剂及混剂。据报道，马铃薯晚疫病菌已对甲霜灵、精甲霜灵和氟吡菌胺等药剂产生了不同水平的抗性。霜脲氰是 1976年由美国杜邦公司（现为科迪华农业科技有限责任公司）开发，对植物病原卵菌具有良好防治效果。霜脲氰对马铃薯晚疫病菌菌丝生长的抑制活性明显高于对孢子囊释放游动孢子、孢子囊和休止孢萌发的抑制活性，并且可以抑制马铃薯晚疫病菌RNA和DNA的合成，但具体作用机理尚不明确。SUJKOWSKI等发现墨西哥 75株马铃薯晚疫病菌对霜脲氰均表现敏感；HAMLEN等研究发现，在霜脲氰应用 16年后，全球范围采集的238株马铃薯晚疫病菌对霜脲氰的敏感性未下降；PÉREZ等研究发现，在多年使用精甲霜灵混剂和霜脲氰混剂防治马铃薯晚疫病的秘鲁和厄瓜多尔采集的58株晚疫病菌对精甲霜灵产生高抗，而对霜脲氰明显较为敏感；王文桥等通过紫外诱变和药剂驯化均未获得马铃薯晚疫病菌对霜脲氰的抗性突变体；袁善奎等研究表明，在内蒙古和黑龙江应用霜脲氰近 10年后，未检测到对其敏感性下降的马铃薯晚疫病菌菌株，通过紫外诱变也未获得抗性突变体；王晨等检测发现，马铃薯晚疫病菌51个黑龙江菌株中有10个菌株对霜脲氰低抗，1个菌株中抗，其余为敏感菌株。此外，意大利和法国应用霜脲氰与铜制剂或代森锰锌混剂防治葡萄霜霉病20多年，检测发现葡萄霜霉病菌（）对霜脲氰的敏感性呈轻微下降趋势。【本研究切入点】河北、内蒙古和吉林一季作马铃薯主产区使用霜脲氰及混剂防治晚疫病已有20余年，近年来晚疫病菌对霜脲氰的敏感性变异和霜脲氰单剂及其混剂对晚疫病的田间防治效果尚不明确。【拟解决的关键问题】检测2011—2019年采自河北、内蒙古和吉林北方一季作区的824株马铃薯晚疫病菌对霜脲氰的敏感性，通过比较不同年份和不同省（自治区）采集分离的菌株对霜脲氰的平均EC、平均抗性倍数、抗性频率和抗性指数，分析马铃薯晚疫病菌对霜脲氰抗性发展动态；通过田间药效试验，验证霜脲氰单剂及其混剂对马铃薯晚疫病的防治效果，为马铃薯晚疫病菌的抗药性治理和马铃薯晚疫病的高效化学防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 2011—2019年，于河北省承德市围场满族蒙古族自治县（简称围场县）和张家口市沽源县、张北县，内蒙古自治区锡林郭勒盟多伦县、赤峰市喀喇沁旗和呼伦贝尔市海拉尔区及吉林省松原市宁江区、延边朝鲜族自治州敦化市，每个市（县）选择 3—5个马铃薯集中种植区采集新鲜马铃薯晚疫病病叶，共分离鉴定到824个菌株（表1）。

表1 2011—2019年河北、内蒙古和吉林马铃薯晚疫病菌菌株采集分离情况Table 1 Strains of P. infestans of potato collected and separated in Hebei, Inner Mongolia and Jilin from 2011 to 2019

1.1.2 供试马铃薯 田间种植感病品种‘费乌瑞它’用于药效试验。

1.1.3 供试药剂 95%霜脲氰原药，上海杜邦农化有限公司（现为科迪华农业科技有限责任公司）。将原药用丙酮溶解，加入无菌水将其制备成1 g·L母液，用于马铃薯晚疫病菌对霜脲氰的敏感性测定。20%霜脲氰SC，瑞士先正达作物保护有限公司；80%代森锰锌 WP，美国陶氏益农公司（现为科迪华农业科技有限责任公司）；72%霜脲氰·代森锰锌WP，美国杜邦公司（现为科迪华农业科技有限责任公司）；52.5%噁唑菌酮·霜脲氰WG，甘肃华实农业科技有限公司；68%精甲霜灵·代森锰锌WG，先正达（苏州）作物保护有限公司。用于田间药效试验。

1.1.4 供试培养基 黑麦蔗糖琼脂培养基（rye sucrose agar，RSA）：黑麦70 g，蔗糖20 g，琼脂粉12 g，蒸馏水定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 马铃薯晚疫病菌对霜脲氰的敏感性测定 将1.1.3中制备好的霜脲氰母液用无菌水系列稀释后定量加入RSA培养基中，制成含霜脲氰为1、0.5、0.1、0.05、0.01 μg·mL的平板并设空白对照和溶剂对照，采用菌丝生长速率法检测晚疫病菌对霜脲氰的敏感性。

1.2.2 马铃薯晚疫病菌对霜脲氰的敏感型划分和抗性指数计算 参照马铃薯晚疫病菌对霜脲氰敏感基线（（0.20±0.06）μg·mL），按照“马铃薯晚疫病菌抗药性检测技术规程（DB13/T 1420—2011）”的分级标准划分晚疫病菌各菌株对供试药剂的抗性等级并计算抗性倍数，参考ZHAO等的方法计算抗性指数。

1.2.3 杀菌剂田间药效试验 河北省围场县克勒沟镇孢子沟村马铃薯种植区长期使用霜脲氰混剂等杀菌剂防治晚疫病，该地晚疫病菌对霜脲氰表现为敏感和低抗。2018—2019年在该地开展霜脲氰单剂及其与代森锰锌或噁唑菌酮混剂对晚疫病田间药效验证试验，施药剂量参考各药剂的推荐剂量，试验共设5个药剂处理，设清水为对照（表2）。晚疫病零星发生时，采用背负式手动喷雾器（新加坡利农，Jacto-HD 400型）进行茎叶喷施，施药量900 L·hm，共施药3次，间隔期7 d。每处理4次重复，小区面积为100 m，采用随机区组排列。

表2 霜脲氰等5种药剂田间药效试验施药剂量Table 2 The recommended dosages of cymoxanil and the other four fungicides in field efficacy trial

1.2.4 数据统计与分析 按照“农药田间药效试验准则（一）杀菌剂防治马铃薯晚疫病（GB/T17980.34—2000）”的标准调查病害级别，计算病情指数与防治效果。施药前调查病情基数，因极零星发病，病情基数视为0。

数据采用DPS 7.05软件进行分析，采用最小显著性差异法（LSD）对供试菌株平均EC、平均抗性倍数及田间试验各处理防治效果进行差异显著性检验。

2 结果

2.1 马铃薯晚疫病菌对霜脲氰抗性发生的时间动态

2011—2019年从河北、内蒙古和吉林马铃薯主产区采集分离到的824株晚疫病菌对霜脲氰较为敏感，2011和2017年仅检测到敏感菌株，2012—2016年和2018—2019年检测到敏感和低抗菌株，未检测到中抗和高抗菌株。2011—2019年中每年采集分离到的菌株对霜脲氰的平均 EC为 0.06—0.44 μg·mL，平均抗性倍数为0.29—2.18，2012—2016年抗性菌株频率为1.90%—58.57%，2018年和2019年抗性菌株频率分别为20.83%和88.14%，抗性指数为0.25—0.47。晚疫病菌对霜脲氰的平均EC、平均抗性倍数、抗性频率和抗性指数随着监测年限不断波动，整体上呈现先增长后下降再增长的低位平稳趋势（表3）。

表3 2011—2019年河北、内蒙古和吉林马铃薯晚疫病菌对霜脲氰的抗性时间动态Table 3 Temporal dynamics of resistance of P. infestans to cymoxanil in Hebei, Inner Mongolia and Jilin from 2011 to 2019

2011—2019年河北、内蒙古和吉林3个地区晚疫病菌对霜脲氰的平均EC分别为0.05—0.47、0.07—0.40 和 0.06—0.44 μg·mL，平均抗性倍数分别为 0.25—2.35、0.33—1.98和0.28—2.18，抗性指数分别为0.25—0.48、0.25—0.48和 0.25—0.44。2011、2014和 2017年在河北仅检测到敏感菌株，其他年份抗性菌株频率为5.77%—90.48%；2011、2016和2017年在内蒙古仅检测到敏感菌株，其他年份抗性菌株频率为4.17%—90.00%；2011、2016和2017年在吉林仅检测到敏感菌株，其他年份抗性菌株频率为 2.70%—77.78%（图1）。

图1 2011—2019年河北、内蒙古和吉林马铃薯晚疫病菌对霜脲氰的敏感性变异动态Fig. 1 Sensitivity variation dynamics of P. infestans to cymoxanil in Hebei, Inner Mongolia and Jilin from 2011 to 2019

2.2 马铃薯晚疫病菌对霜脲氰抗性发生的空间动态

河北、内蒙古和吉林 3个地区的马铃薯晚疫病菌对霜脲氰的平均 EC分别为 0.18、0.18、0.17 μg·mL，平均抗性倍数分别为 0.91、0.90、0.85，抗性菌株频率分别为22.22%、18.75%、16.61%，抗性指数分别为0.31、0.30、0.29。3个地区之间晚疫病菌对霜脲氰的平均EC和平均抗性倍数无显著性差异，河北晚疫病菌抗性菌株频率高于内蒙古和吉林，3个地区晚疫病菌对霜脲氰抗性指数相近，均处于低位（表4）。

表4 河北、内蒙古和吉林马铃薯晚疫病菌对霜脲氰的抗性空间动态Table 4 Spatial dynamics of resistance of P. infestans to cymoxanil in Hebei, Inner Mongolia and Jilin

2.3 杀菌剂田间防治效果

2018年田间药效试验结果显示20%霜脲氰SC、72%霜脲氰·代森锰锌 WP和 52.5%噁唑菌酮·霜脲氰WG对马铃薯晚疫病的防治效果为81.5%—83.9%，显著高于80%代森锰锌WP的防治效果（76.9%）。80%代森锰锌WP的防治效果显著高于68%精甲霜灵·代森锰锌WG的防治效果（61.8%）。2019年田间药效试验结果显示72%霜脲氰·代森锰锌WP和52.5%噁唑菌酮·霜脲氰 WG对马铃薯晚疫病的防治效果分别为87.1%和85.2%，显著高于20%霜脲氰SC的防治效果（81.8%）。20%霜脲氰SC的防治效果显著高于80%代森锰锌 WP的防治效果（79.4%）。80%代森锰锌WP对晚疫病的防治效果显著高于68%精甲霜灵·代森锰锌WG的防治效果（69.3%）（表5）。

表5 霜脲氰及其混剂对马铃薯晚疫病的田间防治效果Table 5 Control efficacy of cymoxanil and the mixed fungicides containing cymoxanil in controlling potato late blight in the fields

3 讨论

3.1 马铃薯晚疫病菌对霜脲氰抗性变异时空动态

河北、内蒙古和吉林北方马铃薯一季作区使用霜脲氰混剂防治晚疫病逾20年，在2011和2017年仅检测到敏感菌株，2012—2016年和2018—2019年检测到敏感和低抗菌株，与王晨等对黑龙江省的检测结果较为一致。不同年度间晚疫病菌对霜脲氰抗性频率和抗性指数虽有波动，但整体上抗性水平和抗性指数维持低位。国内外及本研究抗性监测结果均表明马铃薯晚疫病菌对霜脲氰抗性发展缓慢，印证了室内致病疫霉对霜脲氰抗性风险低的评估结果。究其原因，可能是由于霜脲氰对马铃薯晚疫病菌作用机制独特，且与生产中现用的嘧菌酯、烯酰吗啉和氟噻唑吡乙酮等高效药剂及已产生抗性问题的甲霜灵和氟吡菌胺之间不存在交互抗性，导致晚疫病菌对霜脲氰不容易产生抗性。另外，还可能与生产中普遍采用霜脲氰与持效期较长的其他杀菌剂（代森锰锌、噁唑菌酮等）混用，并与100 g·L氰霜唑SC、50%氟啶胺SC、687.5 g·L氟吡菌胺·霜霉威SC、50%烯酰吗啉WP、69%烯酰吗啉·代森锰锌WG和23.4%双炔酰菌胺SC等多种作用机理的高效杀菌剂交替使用，降低了霜脲氰使用频率及其对晚疫病菌群体的选择压力有关。

3.2 霜脲氰及其混剂对马铃薯晚疫病田间药效验证

对于已知作用靶标位点药剂的抗性研究，可通过比较抗性菌株与敏感菌株药剂作用靶标位点是否发生氨基酸突变进行验证。霜脲氰直接作用机理不清，田间马铃薯晚疫病菌对其是否产生抗性只能通过田间药效试验验证。

河北省围场县为我国北方一季作马铃薯主产区，当地晚疫病菌对甲霜灵抗性菌株出现频率高达100%，且均为高抗菌株。目前生产中，每个生长季防治晚疫病用药4—6次，主要采用代森锰锌、氢氧化铜、烯酰吗啉、霜脲·锰锌、氟吡菌胺·霜霉威、噁唑菌酮·霜脲氰等药剂交替使用。河北省围场县克勒沟镇孢子沟村马铃薯种植区晚疫病菌在 2011—2019年仅检测到对霜脲氰的敏感菌株和低抗菌株，未发现中高抗菌株。在该地进行霜脲氰及其混剂对晚疫病的田间药效试验，发现 20%霜脲氰 SC、72%霜脲氰·代森锰锌 WP和52.5%噁唑菌酮·霜脲氰WG对马铃薯晚疫病防治效果良好，与该试验点晚疫病菌对霜脲氰较为敏感的抗性监测结果一致。对照药剂 68%精甲霜灵·代森锰锌WG对马铃薯晚疫病的防治效果较差，亦与该试验点晚疫病菌对甲霜灵产生高抗的监测结果一致。田间药效试验结果表明 20%霜脲氰 SC、72%霜脲氰·代森锰锌WP和52.5%噁唑菌酮·霜脲氰WG在甲霜灵高抗地区可替代 68%精甲霜灵·代森锰锌 WG防治马铃薯晚疫病。

3.3 马铃薯晚疫病菌对霜脲氰抗性风险管理策略

室内试验或应用霜脲氰混剂防治马铃薯晚疫病的田间实践均表明霜脲氰用于马铃薯晚疫病防治存在较低抗性风险，与杀菌剂抗性行动委员会（FRAC）将霜脲氰列为中低抗性风险药剂一致。但是，马铃薯晚疫病菌被认定为中抗性风险病原菌，本文研究结果及王晨等的研究显示在我国河北、内蒙古、吉林和黑龙江等北方马铃薯一季作区已出现对霜脲氰的低抗及极少数中抗晚疫病菌菌株，因此不能忽视马铃薯晚疫病菌对霜脲氰的抗性风险管理。建议继续监测马铃薯晚疫病菌对霜脲氰的抗性动态；在掌握田间抗性发展动态基础上，推广应用霜脲氰与嘧菌酯、烯酰吗啉、氟吡菌胺、氰霜唑和氟噻唑吡乙酮等新型高效药剂的混剂，并将72%霜脲氰·代森锰锌WP和52.5%噁唑菌酮·霜脲氰WG等混剂与嘧菌酯、烯酰吗啉、氟噻唑吡乙酮、氰霜唑和氟吡菌胺·霜霉威等新型高效药剂交替使用，避免在发病较重时铲除性施药；限制每个生长季节每种中高抗性风险药剂的使用不超过两次；开展以利用抗性品种、高垄大畦栽培和交替、混合使用不同作用机制药剂为核心措施的综合防治，减少霜脲氰等内吸性药剂的使用频率，降低抗性选择压。

4 结论

河北、内蒙古和吉林北方一季作区马铃薯晚疫病菌群体对霜脲氰敏感性下降缓慢，总体上保持敏感，抗性水平较低。不同年份间晚疫病菌对霜脲氰抗性频率波动很大，抗性指数波动平缓，长期处于低位。不同地区间河北晚疫病菌对霜脲氰抗性频率高于内蒙古和吉林，3个地区抗性指数相近。马铃薯晚疫病菌对霜脲氰抗性监测结果与霜脲氰单剂及其与代森锰锌或噁唑菌酮混剂对晚疫病药效验证结果较为一致。在马铃薯晚疫病菌对甲霜灵和精甲霜灵产生抗性的地区，霜脲氰单剂及72%霜脲氰·代森锰锌WP和52.5%噁唑菌酮·霜脲氰 WG等霜脲氰混剂可作为精甲霜灵·代森锰锌的替代药剂使用。