1-磷酸鞘胺醇通过其受体3改善压力超负荷诱导的病理性心肌肥厚

陈铿铨 王忠芹 刘超 杨星 蒋建刚

430030 武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科，心血管病遗传与分子机制湖北省重点实验室(陈铿铨、王忠芹、刘超、杨星)；430030 武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科(蒋建刚)

1-磷酸鞘胺醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)是生物膜上膜磷脂代谢的中间产物，是近年来发现具有重要生物学功能的小分子化合物。S1P由鞘胺醇激酶催化鞘胺醇而生成，并通过S1P裂解酶降解成磷酸乙醇胺或十六醛[1]。S1P发挥其生物学功能通过两种途径，一是作为第二信使直接作用于细胞内的相应靶点[2]，二是分泌到细胞外从而作用于细胞膜上的受体[3]，S1P主要通过后者发挥其生物学功能。在心血管系统中，主要表达S1P受体1(sphingosine-1-phosphate receptor 1，S1PR1)、S1PR2和S1PR3[4-5]。以往研究表明，S1P具有心脏保护作用，能抑制缺氧诱导的心肌细胞和内皮细胞凋亡，具有抗炎、抗动脉粥样硬化和降低心肌梗死后的氧化应激水平等作用[6-8]。在我们的前期研究中发现，S1P能改善心肌肥大[9]，但尚不明确S1P是通过哪一型受体发挥该作用的。前期的一项研究发现，S1P能通过内皮细胞上的S1PR1发挥抗病理性心肌肥厚的作用[10]，而S1PR3在心肌细胞中表达丰度次于S1PR1，在心脏成纤维细胞中表达丰度最高，且目前尚无明确报道关于S1P/S1PR3在病理性心肌肥厚中的作用。因此，本实验旨在探讨S1P/S1PR3在病理性心肌肥厚中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

S1P(Cayman Chemical公司)；2-乙酰基-5-四羟基丁基咪唑[2-acetyl-4(5)-tetrahydroxybutyl imidazole，THI](Cayman Chemical公司)；血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)(Master of Bioactive Molecules公司)；S3I-201(STAT3抑制剂)(Master of Bioactive Molecules公司)；H2O2(Sigma-Aldrich公司)；p-STAT3抗体(1∶1 000，Cell signaling公司)；t-STAT3抗体(1∶1 000，Cell signaling公司)；MYH7抗体(1∶1 000，Abcam公司)；ANP抗体(1∶1 000，Abcam公司)；S1PR3抗体(1∶2 000，Abcam公司)；GAPDH抗体(1∶1 000，Abcam公司)；HRP标记山羊抗兔IgG二抗(武汉赛维尔生物科技有限公司)；HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗(武汉赛维尔生物科技有限公司)；qPCR SYBR Green Master Mix(翌圣生物科技股份有限公司)；RT-PCR引物合成(武汉奥科生物科技技术有限公司)。

1.2 实验动物

所有动物实验均经过华中科技大学同济医学院实验动物伦理委员会批准。S1PR3基因敲除小鼠模型(S1PR3-KO)由上海南方模式生物科技股份有限公司建立，并采用聚合酶链反应(PCR)进行S1PR3基因敲除纯合子(S1PR3-/-)小鼠基因型鉴定。以下4种引物用于小鼠基因型鉴定：P1，5’-GGGACGCAGAGTCGGCTATT-3’；P2，5’-AAAGAAGGGGTGGTAAGGGGAGAC-3’；P3，5’-TTAGCCGCAGCAAATCAGACAACT-3’；P4，5’-AGAAGGGGTGGTAAGGGGAGACAG-3’。对于野生型小鼠，P1和P2引物获得单一的3 662 bp片段，P3和P4引物获得374 bp片段。对于S1PR3基因敲除杂合子(S1PR3+/-)小鼠，P1和P2引物获得856 bp和3 662 bp两个片段；P3和P4引物获得374 bp片段。对于S1PR3-/-小鼠，P1和P2引物获得单一的856 bp片段，P3和P4不能获得条带。

SPF级雄性10～12周龄的C57BL/6野生型(wild-type)小鼠和S1PR3-/-小鼠饲养于同济医学院实验动物中心。根据实验需求，wild-type和S1PR3-/-小鼠分别接受胸主动脉缩窄手术(transverse aortic constriction，TAC)和假手术(sham，手术过程同TAC，但不进行主动脉弓结扎)。手术1周后，wild-type和S1PR3-/-小鼠分别按随机数字表法分成sham组、sham+THI组、TAC组和TAC+THI组。sham+THI组和TAC+THI组以灌胃的方式每天两次给予THI(10 μg/mouse)干预，而sham组和TAC组则给予药物溶剂干预。THI干预7周后，心脏超声检测小鼠心功能以及取小鼠心脏进行后续的实验检测。

1.3 小鼠心脏超声检测

在使用1.5%的异氟烷麻醉小鼠后，使用配有30 MHz高频探头的VisualSonic Vevo770型超声仪获取5个以上连续心动周期M型超声影像，采集影像后使用分析软件进行分析。

1.4 细胞处理

人心肌细胞系(AC16)购自美国菌种保藏中心(ATCC)，使用含有10%青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 μg/ml)和10%的胎牛血清(Gibco公司)的DMEM培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(Gibco公司)在37℃及5% CO2的细胞培养箱中培养。细胞处理分组，AngⅡ组：1 μM AngⅡ处理48 h；AngⅡ+S1P组：1 μM S1P预孵育1 h后，用1 μM AngⅡ处理48 h；AngⅡ+S1P+S3I-201组：1 μM S1P和5 μM S3I-201预孵育1 h后，用1 μM AngⅡ处理48 h。H2O2组：100 μM H2O2处理24 h；H2O2+S1P组：1 μM S1P预孵育1 h后，100 μM H2O2处理24 h；H2O2+S1P+S3I-201组：1 μM S1P和5 μM S3I-201预孵育1 h后，用100 μM H2O2处理24 h。

1.5 蛋白质印迹法(Western blot)实验

将干预结束的各组AC16细胞加入预冷的细胞裂解液，于冰上裂解20 min，收集细胞裂解液于4℃离心机离心15 min，收集上清液后采用BCA蛋白定量法测定各组蛋白浓度，并加入相应体积的loading buffer，于100℃水浴变性。经过SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5% BSA封闭1.5 h后，以及相应的一抗工作液4℃孵育过夜和二抗室温孵育1.5 h后，PVDF膜使用ECL化学发光试剂盒在化学发光凝胶成像仪上拍照，之后使用Image J软件检测蛋白条带灰度值并进行分析。

1.6 免疫荧光染色

细胞爬片经过固定和通透后，或心脏组织切片经过脱蜡复水及抗原修复后，用5% BSA在室温下封闭2 h。滴入麦胚凝集素(WGA)染液(碧云天公司)于细胞爬片或组织切片上，放置于37℃温箱避光孵育1 h，1×PBS清洗3遍后，在荧光显微镜下观察并拍照。使用FITC-Phalloidin(武汉赛维尔生物科技有限公司)染色工作液和细胞一起在37℃温箱避光孵育30 min后，经过1×PBS洗3遍后使用DAPI染色液对细胞核进行染色，PBS洗涤后在荧光显微镜下观察并拍照。使用含有1 μM的二氢乙啶(dihydroethidium，DHE)溶液和细胞或组织切片一起在37℃温箱避光孵育30 min后，经过适当的洗涤，在荧光显微镜下观察拍照。

1.7 苏木素-伊红(HE)染色

取小鼠心脏组织，在4%中性多聚甲醛固定24 h后，经过石蜡包埋，使用石蜡切片机进行切片，厚度约5 μm。心脏组织切片经过二甲苯脱蜡和梯度乙醇复水后，使用HE染色试剂盒进行染色。在中性树胶封片后，在显微镜下对心脏组织切片进行观察并拍照。

1.8 RNA提取和实时反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)

使用组织RNA柱式提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)提取各组心脏组织总RNA，经紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度。按照反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)说明书进行cDNA合成。按照SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明书进行RT-PCR反应液配置，并利用ABI 7500 fast实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems)对BNP、MYH6、S1PR3和GAPDH的mRNA的表达进行定量分析。PCR反应条件：预变性95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，30 s；循环40次。以GAPDH的mRNA作为内参，使用2-△△Ct方法计算基因相应mRNA的表达量。引物序列见表1(其中S1PR3引物序列在文献中获得)[11]。

表1 实时荧光定量PCR引物信息

1.9 酶联免疫吸附(ELISA)实验

THI干预7周后，采集各组小鼠血浆以及取小鼠心脏组织制备组织匀浆。按照产品说明书，使用小鼠S1P ELISA检测试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)检测各组小鼠血浆和心脏组织中S1P水平，并使用不同浓度S1P标准品制备标准曲线，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，根据标准曲线，计算样品浓度。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 THI升高小鼠体内S1P水平，并通过S1PR3改善小鼠心功能

使用PCR法鉴定wild-type、S1PR3+/-和S1PR3-/-小鼠的基因型。对于S1PR3-/-小鼠，P1和P2引物获得单一的856 bp片段，P3和P4不能获得条带(图1A)。Western bolt和qPCR技术检测S1PR3 mRNA及蛋白的表达情况，结果显示S1PR3-/-小鼠心脏组织中S1PR3几乎不表达(图1B和1C)，提示S1PR3-/-小鼠模型建立成功。THI是S1P裂解酶抑制剂，抑制S1P裂解酶能显著升高S1P的水平[12]。THI干预7周后，检测各组小鼠血浆和心脏组织中S1P水平，发现与非THI干预组相比，THI干预组小鼠的血浆和心脏组织中S1P水平显著升高，差异有统计学意义(均为P<0.001)(图1D和1E)；此外，对比sham组，TAC组小鼠血浆和心脏组织中S1P水平明显下降(均为P<0.001)，提示在压力超负荷诱导的心力衰竭小鼠模型中，S1P的生成减少以及S1P的心脏保护功能被削弱[13](图1D和1E)。心脏超声结果提示，在wild-type小鼠中，与TAC组相比，给予THI能显著改善小鼠心功能，差异有统计学意义(图1F～1J)；相反，在S1PR3-/-小鼠中，TAC组和TAC+THI组小鼠的心功能比较并无统计学差异(图1F～1J)，提示S1P可能通过S1PR3改善小鼠心功能。

2.2 S1P通过S1PR3改善压力超负荷诱导的病理性心肌肥厚

HE和WGA染色显示，在wild-type小鼠中，与TAC组相比，THI能改善压力超负荷诱导的心肌肥大(P<0.001)(图2A～2C)；然而，在S1PR3-/-小鼠中，TAC组和TAC+THI组小鼠的心肌细胞横截面积大小并无统计学差异(图2A～2C)。其次，心脏超声结果显示，在wild-type小鼠中，TAC组小鼠的左室质量增加，而THI能降低左室质量(P=0.04)(图2D)。同样，THI能降低心脏重量与胫骨长度的比值(HW/TL)(P<0.01)(图2E)；相反，在S1PR3-/-小鼠中，压力超负荷诱导左室质量和HW/TL增加，但THI不能降低左室质量和HW/TL(图2D～2E)。Western blot和qPCR结果表明，在wild-type小鼠中，对比TAC组，THI能降低心肌肥厚标志物ANP、BNP和MYH7的表达，促进MYH6的表达，差异有统计学意义(图2F～2J)；但在S1PR3-/-小鼠中，心肌肥厚标志物的表达在TAC组和TAC+THI组中并无统计学差异(图2F～2J)。上述结果提示，S1P可能通过S1PR3改善压力超负荷诱导的病理性心肌肥厚。

2.3 S1P通过S1PR3减少压力超负荷诱导活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成

给予wild-type小鼠THI干预7周后，对比TAC组，DHE荧光染色显示，TAC+THI组的小鼠心脏组织中ROS水平显著降低(P<0.001)。然而，THI并不能降低S1PR3-/-小鼠心脏组织中ROS水平(图3)。上述结果提示，S1P能减少压力超负荷诱导心脏组织中的ROS生成，且可能通过S1PR3发挥该作用。

2.4 S1P通过JAK/STAT3信号通路抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大

JAK/STAT3是S1P/S1PR3下游的信号通路，已有文献报道S1P可通过JAK/STAT3信号通路发挥心脏保护作用[14]。对比sham组小鼠，压力超负荷(TAC)降低了心脏组织中磷酸化STAT3的蛋白表达水平(P<0.001)。然而，给予wild-type小鼠THI干预后，Western blot实验显示，心脏组织中磷酸化STAT3的蛋白表达水平显著增加(P<0.01)。但在S1PR3-/-小鼠中，THI并没有升高心脏组织中磷酸化STAT3的蛋白表达水平(图4A和4B)。

S3I-201是STAT3的特异性抑制剂。Phalloidin免疫荧光结果显示，S1P能抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大(P<0.001)，而给予S3I-201预处理后S1P的抗心肌肥大作用被逆转(P<0.01)(图4C和4E)。同样，Western blot分析表明，S1P下调了AngⅡ诱导的心肌肥大标志物的表达(P<0.001)，而S3I-201则促进了心肌肥大标志物的表达，差异有统计学意义(图4D、4F和4G)。提示S1P可能通过JNK/STAT3信号通路发挥抗心肌细胞肥大的作用。

sham：假手术组；sham+THI：假手术+2-乙酰基-5-四羟基丁基咪唑组；TAC：胸主动脉缩窄术组；TAC+THI：胸主动脉缩窄术+2-乙酰基-5-四羟基丁基咪唑组。A：PCR法鉴定小鼠基因型；B和C：Western blot和qPCR技术检测wild-type和S1PR3-/-小鼠心脏组织中S1PR3的表达情况；D：TAC 8周后，wild-type和S1PR3-/-小鼠各组血浆中的S1P浓度；E：TAC 8周后，wild-type和S1PR3-/-小鼠各组心脏组织中的S1P浓度；F：wild-type和S1PR3-/-小鼠各组代表性心脏超声图片；G：wild-type和S1PR3-/-小鼠各组左室射血分数(LVEF)；H：wild-type和S1PR3-/-小鼠各组左室缩短分数(LVFS)；I：wild-type和S1PR3-/-小鼠各组左室收缩期内径(LVID；s)；J：wild-type和S1PR3-/-小鼠各组左室舒张期内径(LVID；d)。与sham组比较，aaaP<0.001；与TAC组比较，bbP<0.01，bbbP<0.001(n=6)。ND：not detected(未检测到)图1 THI显著升高小鼠体内S1P水平和通过S1PR3改善小鼠心功能

sham：假手术组；sham+THI：假手术+2-乙酰基-5-四羟基丁基咪唑组；TAC：胸主动脉缩窄术组；TAC+THI：胸主动脉缩窄术+2-乙酰基-5-四羟基丁基咪唑组。A：wild-type和S1PR3-/-小鼠各组代表性的心脏组织HE染色图片；B：wild-type和S1PR3-/-小鼠各组代表性的心脏组织WGA染色图片；C：wild-type和S1PR3-/-小鼠各组心肌细胞横截面积大小；D：wild-type和S1PR3-/-小鼠各组左室质量(LV mass)；E：wild-type和S1PR3-/-小鼠各组心脏重量与胫骨长度的比值(HW/TL)；F、G和H：western blot检测wild-type和S1PR3-/-小鼠各组心脏组织中ANP和MYH7的蛋白表达变化；I和J：qPCR检测wild-type和S1PR3-/-小鼠各组心脏组织中BNP和MYH6 mRNA的表达变化。与sham组比较，aP<0.05，aaaP<0.001；与TAC组比较，bP<0.05，bbP<0.01，bbbP<0.001(n=6)图2 S1P通过S1PR3改善压力超负荷诱导的病理性心肌肥厚

sham：假手术组；sham+THI：假手术+2-乙酰基-5-四羟基丁基咪唑组；TAC：胸主动脉缩窄术组；TAC+THI：胸主动脉缩窄术+2-乙酰基-5-四羟基丁基咪唑组。A和B：wild-type和S1PR3-/-小鼠各组代表性的心脏组织DHE荧光染色图片和统计图。与sham组比较，aaaP<0.001；与TAC组比较，bbbP<0.001(n=6)图3 S1P通过S1PR3减少压力超负荷诱导ROS的生成

2.5 S1P通过JAK/STAT3信号通路发挥抗氧化应激作用

给予AC16细胞S1P预处理后，DHE荧光染色结果显示，S1P降低H2O2诱导的ROS水平(P<0.001)，但加入S3I-201抑制STAT3的活性后ROS水平显著升高(P<0.001)(图5)。提示S1P通过JAK/STAT3信号通路发挥抗氧化应激作用。

3 讨论

心力衰竭是大多数心血管疾病的最终归宿，也是最主要的死亡原因之一[15]。心肌肥大是心脏对血流动力学超负荷的一种代偿性反应，在持续的压力超负荷和心脏损伤下，心脏无法再代偿，则从代偿性肥大发展为失代偿性肥大，导致心功能障碍和心脏结构发生病理性重构，最后发展为心力衰竭[16-17]。因此，防治病理性心肌肥厚是延缓心力衰竭发生发展的一个重要治疗靶点[18]。

S1P主要与S1P受体结合后发挥其生物学功能。在心血管系统中，主要表达S1PR1、S1PR2和S1PR3三种受体。在心肌细胞中，S1PRs的表达丰

sham：假手术组；sham+THI：假手术+2-乙酰基-5-四羟基丁基咪唑组；TAC：胸主动脉缩窄术组；TAC+THI：胸主动脉缩窄术+2-乙酰基-5-四羟基丁基咪唑组；Con：对照组；AngⅡ：血管紧张素Ⅱ组；AngⅡ+S1P：血管紧张素Ⅱ+1-磷酸鞘胺醇组；AngⅡ+S1P +S3I-201：血管紧张素Ⅱ+1-磷酸鞘胺醇+STAT3抑制剂组。A和B：Western blot检测wild-type和S1PR3-/-小鼠各组心脏组织中磷酸化STAT3的蛋白表达变化(n=6)；C和E：FITC-Phalloidin染色心肌细胞微丝以显示心肌细胞横截面积大小的代表性图片和统计图；D、F和G：Western blot检测各组心肌细胞中ANP和MYH7的蛋白表达变化。与sham组或Con组比较，aaaP<0.001；与TAC组或AngⅡ组比较，bbP<0.01，bbbP<0.001；与AngⅡ+S1P组比较，ccP<0.01，cccP<0.001(n=3)图4 S1P通过JAK/STAT3信号通路抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大

Con：对照组；H2O2：过氧化氢组；H2O2+S1P：过氧化氢+1-磷酸鞘胺醇组；H2O2+S1P +S3I-201：过氧化氢+1-磷酸鞘胺醇+STAT3抑制剂组。A和B：DHE染色显示心肌细胞中ROS水平的代表性图片及统计图。与Con组比较，aaaP<0.001；与H2O2组比较，bbbP<0.001；与H2O2+S1P组比较，cccP<0.001(n=3)图5 S1P通过JAK/STAT3信号通路减少心肌细胞中ROS的生成

度依次为S1PR1>S1PR3>S1PR2；在心脏成纤维细胞中，S1PRs的表达丰度依次为S1PR3>S1PR1>S1PR2[5]。既往研究表明，S1P可通过S1PR1和S1PR3促进内皮细胞增殖和抑制其凋亡，调节血管发生和诱导新生血管形成[19-20]；另一方面，S1P分别激活S1PR1和S1PR3发挥抗心脏缺血再灌注损伤[21-22]。上述研究表明S1PR1和S1PR3具有相似的心脏保护效应。既往研究表明，S1P能通过内皮细胞上S1PR1发挥抗病理性心肌肥厚的作用[10]，而在本研究中，我们发现S1P通过S1PR3改善压力超负荷诱导的病理性心肌肥厚，表明S1PR1和S1PR3具有相似的抗病理性心肌肥厚的作用。

在本研究中，我们发现S1P通过S1PR3改善压力超负荷诱导的病理性心肌肥厚和降低ROS水平。但对比wild-type和S1PR3-/-小鼠的TAC组，心肌细胞横截面积大小和心脏组织中ROS水平并无统计学差异，提示S1PR3基因并不参与压力超负荷诱导的病理性心肌肥厚和ROS产生的发展。既往研究发现，wild-type 和S1PR3-/-小鼠心肌梗死模型或离体心脏缺血再灌注模型的心脏梗死面积大小并无统计学差异[21]。此外在2001年Ishii等[23]发现，与wild-type小鼠相比，S1PR3-/-小鼠发育正常，且无明显的表型异常，提示S1PR3基因在小鼠的正常发育过程中并未起到重要的作用。所以上述研究提示，S1PR3基因可能没有参与压力超负荷诱导的病理性心肌肥厚的发展。

越来越多的研究表明，氧化应激与心力衰竭发生发展密切相关[24]。过量ROS的产生会导致心肌细胞功能障碍，最后导致不可逆的细胞损伤或死亡[25]，所以抗氧化应激是防治心力衰竭的一个重要药物干预靶点。已有研究表明S1P具有抗氧化应激作用[26]，但目前尚无S1P/S1PR3与压力超负荷诱导的氧化应激之间关系的相关报道。在本研究中，我们发现S1P通过S1PR3发挥抗压力超负荷诱导的氧化应激的作用，提示S1P可能通过S1PR3减少ROS的产生进而改善病理性心肌肥厚。

JAK/STAT3是S1P下游的一条重要的信号通路。以往研究表明，S1P能激活JAK/STAT3信号通路发挥保护心脏的作用[14， 27]。在本研究中，我们发现S1P可能通过S1PR3激活JAK/STAT3信号通路从而发挥其心脏保护作用。但仍需在未来的研究中，通过体内、外实验明确S1P是否通过S1PR3/JAK/STAT3信号通路发挥抗病理性心肌肥厚和抗氧化应激的作用。

在本研究中，我们选择使用S1PR3-/-小鼠进行研究，而不是选择心肌细胞S1PR3基因特异性敲除鼠，是由于目前并无明确的对S1PR3与心力衰竭病理性心肌肥厚之间的关系的文献报道。另外，S1P是否通过心肌细胞上的S1PR3发挥抗心力衰竭病理性心肌肥厚的作用也尚未见报道，以及S1P是否通过心脏中非心肌细胞上的S1PR3对心肌细胞产生影响进而发挥抗心力衰竭病理性心肌肥厚的作用也尚未明确。所以，本研究设想首先通过构建S1PR3-/-小鼠，明确S1P/S1PR3与心力衰竭病理性心肌肥厚之间的关系，在后续的实验中进一步探究S1P是通过心脏中哪种细胞类型上的S1PR3发挥抗心力衰竭病理性心肌肥厚的作用。

本研究存在不足之处：本次研究尚未阐明S1P通过心脏中哪一种细胞类型上的受体发挥其生物学效应，这需要建立心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞等细胞类型的条件性S1PR3基因敲除鼠来进行下一步的研究。此外，还需要在体内外实验中探索S1P是否通过S1PR3激活JAK/STAT3信号通路发挥抗病理性心肌肥厚和抗氧化应激的作用。综上所述，本次研究发现，S1P通过S1PR3发挥抗病理性心肌肥厚和抗氧化应激的作用，且可能通过JAK/STAT3信号通路发挥该作用，为防治心力衰竭的药物研发提供了理论基础，未来可通过激活S1PR3从而延缓心力衰竭的发生发展。

利益冲突：无