不同浓度N 营养条件对水稻生长发育和C、N 代谢的影响

蒋欣瑜，胡晓渝，吕 蔺，胡秋涛，魏涵天，林新春，许永汉*

(1. 安徽农业大学农学院，合肥 230036；2. 浙江农林大学林业与生物技术学院，杭州 311300)

氮是作物生长发育必需的大量营养元素，增施化学氮肥，是作物生产采取的主要增产措施之一。然而，近20 年来，我国作物氮施用量逐年升高，氮素利用效率趋于下降，而带来的环境污染则趋于加重[1]。因此，提高氮素利用率，降低其对环境的负面影响，在提高作物产量的同时兼顾生态效益，是当前我国土壤氮素研究的指导思想[1-2]。研究土壤中氮素营养吸收和转化过程，明确其对植株生长影响效果的规律及分子机制，对于合理施用氮肥及保护生态环境具有重要意义。

植株内C、N 代谢贯穿整个生育期。前人研究表明，不同浓度的N 肥对水稻植株生长发育和C、N 有显著差异，但对于不同浓度的N 营养在全生育期内施于水稻时，其植株生长发育和C、N 代谢如何响应还没有系统报道。鉴于此，作者用含有不同浓度N 营养的培养液对水稻进行全生育期水培，分析水稻植株农艺性状、糖代谢（C 代谢）和氨基酸代谢（N 代谢）状态、色素合成代谢和N 转运和代谢关键基因的表达响应，以期为水稻生理代谢分子机制和指导作物施肥提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 水稻全生育期培养条件

所有水稻均在生长箱培养（Thermoline Scientific Equipment Pty. Ltd, Smithfield, Australia）。昼/夜光暗时间（光/暗条件）比例为13 h/11 h，光照时间为6:00 到19:00，光照强度为400 μmol·m-2·s-1。昼/夜温度条件为25 ℃/20 ℃；培养箱维持70%的相对湿度。

水稻基本培养液采用国际水稻所标准配方（IRRI nutrient solution）：1.25 mmol·L-1NH4NO3,0.3 mmol·L-1KH2PO4, 0.35 mmol·L-1K2SO4, 1 mmol·L-1CaCl2.2H2O, 1 mmol·L-1MgSO4·7H2O, 0.5 mmol·L-1Na2SiO3, 20 μmol·L-1NaFeEDTA, 20 μmol·L-1H3BO3, 9 μmol·L-1MnCl2·4H2O, 0.32 μmol·L-1CuSO4·5H2O, 0.77 μmol·L-1ZnSO4·7H2O和0.39 μmol·L-1Na2MoO4·2H2O, pH 5.5。苗期水培营养液每4～5 d 更换1 次，孕穗期开始每3 d 更换1 次。为了抑制硝化作用，营养液添加7 μmol·L-1dicyandiamide （DCDC2H4N4）。

1.2 N 营养配方

N 营养4 种浓度分别为0.05、0.5、2 和5 mmol·L-1, 用NH4NO3作为N 营养源，确保硝态氮（NO3+）:氨态氮（NH4+）= 1:1。

1.3 3 种主要的可溶性糖含量测定

水稻材料在拔节期开始时取样。所有水稻植株材料取样后迅速经105 ℃高温杀青0.5 h，再经80 ℃烘12 h 。将干燥后的植株样品分成根、叶鞘、叶和茎4部分，磨碎。测定主要参照文献用高压液相色谱方法（high pressure liquid chromatography，HPLC）测定3种可溶性糖[3-4]。糖分提取操作规程稍作如下改动：取磨碎后的样品0.1 g放入5 mL离心管，加2 mL蒸馏水，80 ℃水浴提取10 min，3 000 r·min-1离心5 min，上清液转入10 mL 具刻度试管或容量瓶中，剩余残渣继续以蒸馏水溶解离心2 次，确保可溶性糖提取充分。上清液均转入10 mL 试管中，定容，待测。

1.4 游离氨基酸含量测定

有常用的水合茚三酮法测定游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物，其颜色的深浅与游离氨基酸的含量成正比。

1.5 色素含量测定

叶绿素的测定参照文献[5]，步骤如下：取新鲜植物叶片或干材料，擦净表面污物，将叶片剪碎（去掉中脉，宽度1～2 mm），混匀，准确称取剪好的叶片0.100 g（重复3～5 次）分别放到试管中，准确加入95%乙醇（475 mL 无水乙醇定容到500 mL）20 mL， 塞紧试管塞，置暗处24 h（中间摇一次），然后在470 nm、649 nm 和665 nm 下比色。

由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素a、b 在95%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665 nm 和649 nm，类胡萝卜素为470 nm，可据此列出以下关系式：

式中:Ca、Cb分别为叶绿素a 和b 的浓度;Cx·c为类胡萝卜素的总浓度;OD663、OD646和OD470分别为叶绿体色素提取液在波长663 nm、646 nm 和470 nm 下的光密度。

1.6 基因表达定量分析

用荧光实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析基因表达水平。首先用Rneasy kit（Qiagen）提取水稻各组织的总RNA，将至少2 mg总RNA 用RNase-free Dnase I（Invitrogen）消化DNA后，再用逆转录酶试剂盒（Promega）反转录得到cDNA。以OsACTIN2（Os05g36280）基因作内参，内参正向引物5´-GTCAATAACTGGGATGACATGGAG-3´和反向引物5´-AGCTTCATGTATGCCAGGAGATTC-3´[3]。其他所用仪器和试剂包括Real-time PCR Detection System （MyiQ Optical Module；Bio-Rad）和SYBR Green master mix（SYBR PremixEx TaqTMII；TaKaRa Biotechnology）。目标基因和OsACTIN2样品均一化稀释比例分别为1:10、1:100 和1:1 000[6]。

所有基因的表达实时定量PCR 所用引物见表1。

表1 实时定量PCR 引物Table 1 Primers for qRT-PCR

2 结果与分析

为了系统而准确地探究不同浓度外施N营养条件对水稻植株生长发育和C、N 代谢的影响效果，本研究选用常规粳稻品种日本晴作为水稻研究材料。在整个生育期均用营养液培养水稻植株材料。

从整个生长过程来看，在0.5 和2 mmol·L-1N营养条件下，水稻植株生长正常，生育期、株高、根系发育和分蘖数等性状均为正常状态，其中在2 mmol·L-1N 下，单株平均籽粒数（260 粒·株-1）相对最接近正常大田的产量（图 1（a）和（b））。高N 营养条件（5 mmol·L-1）下，株高、根系发育和结实率等性状均受到抑制，分蘖数显著增多，后期实粒数几乎为零，尽管整个植株的生物量较高；而低N营养条件（0.05 mmol·L-1）下，水稻植株株高和分蘖数等农艺性状均受到显著抑制，整个植株的生物量很低，后期虽然结实率不低，但总粒数和实粒数很少，平均每株实粒数只有5 粒左右（图 1（a）和（b））。随着N 浓度升高，叶片明显更绿，植株生育期明显延长，贪青状态也更突出（图 1（a）和（b））。

图1 4 种浓度N 营养处理后植株的性状表现Figure 1 Phenotype of rice plants under 4 kinds of N nutrition conditions

2.2 水稻植株内主要的可溶性糖含量和代谢分析

光合作用主要合成碳水化合物，这些碳同化产物是植株生长发育的物质和能量基础[3,7-8]。为了明确外施N肥对水稻植株光合碳同化合成代谢的影响效果，我们在水稻拔节后测定4 种浓度N 营养处理的水稻各组织3 种主要的可溶性糖含量。结果表明，葡萄糖和果糖在各组织中的含量与N 营养浓度没有显著相关性；而叶片和茎秆中蔗糖含量变化与N 营养浓度呈现明显的规律。正常浓度即0.5 和2 mmol·L-1N 营养条件下，水稻叶片内蔗糖含量比高浓度（即5 mmol·L-1）条件下均高出7 倍，茎秆内均高出2 倍左右；而在低浓度即0.05 mmol·L-1条件下，叶片和茎秆内蔗糖含量更低（图 2）。

图2 4 种N 营养条件处理后水稻各组织内主要的可溶性糖含量Figure 2 Contents of major soluble sugars in the rice plants under 4 kinds of N nutrition conditions

蔗糖是光合作用最主要的产物，也是光合碳同化产物转运的最主要形式[3,7-8]。而叶片为光合作用主要场所，同时，茎秆是蔗糖长距离运输（long-distance transport of sucrose）主要通道，因此，叶片和茎秆中蔗糖含量变化基本上反映了光合作用合成代谢水平[7-8]。由此可以看出，低N 条件很可能导致植株N 营养缺乏，光合碳同化作用降低，而高N 条件（5 mmol·L-1）则可能高度抑制水稻叶片中的光合作用。

因此，以上结果表明根吸收的N 营养直接影响到整体的光合作用，N 浓度0.5 和2 mmol·L-1营养条件最有利于水稻植株的光合作用。

2.3 水稻植株内氨基酸代谢分析

为了系统地分析以上4 种浓度N 营养条件对水稻植株内氨基酸代谢的影响效果，我们测定根、茎、叶鞘和叶等4 种组织中游离氨基酸含量。

表2—表5 数据分析清晰地表明，4 种N 浓度处理的根、茎、叶鞘和叶等4 种组织中游离氨基酸含量在0.05 和0.5 mmol·L-1N 条件下相对很低，而在2 和5 mmol·L-1N 条件下含量显著提高，相较前两者，至少升高1 倍以上。总体上看，大部分游离氨基酸水平随着外施N 浓度增加而提高，说明N 代谢水平随着N 营养浓度增加而提高，N营养促进N 代谢。

表2 4 种N 营养浓度处理后水稻根内游离氨基酸的含量Table 2 Contents of free amino acids in the rice roots under 4 kinds of N nutrition conditions

表3 4 种N 营养浓度处理后水稻茎内游离氨基酸的含量Table 3 Contents of free amino acids in the rice stems under 4 kinds of N nutrition conditions

续表3

表4 4 种N 营养浓度处理后水稻叶鞘内游离氨基酸的含量Table 4 Contents of free amino acids in the rice sheaths under 4 kinds of N nutrition conditions

表5 4 种N 营养浓度处理后水稻叶片内游离氨基酸的含量Table 5 Contents of free amino acids in the rice leaves under 4 kinds of N nutrition conditions

2.4 水稻植株内色素含量和代谢分析

从以上水稻植株表型可以看出，外施N 肥浓度越高，叶色更深绿（图 1（a））。因此，我们在抽穗期取新鲜叶片，测定3 种色素，叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素的含量。结果表明，在0.05 mmol·L-1到2 mmol·L-1N 营养范围内，植株内3 种色素合成代谢随着N 营养浓度升高而显著提高，高N 即5 mmol·L-1N 营养条件并没有显著提高色素合成代谢，也就是说，2 mmol·L-1N 条件下色素合成已经达到最高水平（图 3）；在0.05 mmol·L-1N营养条件下，3 种色素的含量均只有2 mmol·L-1营养条件下的1/3 不到（图 3）。这与上述植株表型的趋势完全一致（图 1），而与以上氨基酸在叶片中含量及蔗糖含量变化趋势不完全一致（表 2）。

图3 4 种N 浓度处理后水稻植株叶片中的色素含量Figure 3 Contents of pigments in the leaves of rice plants under 4 kinds of N nutrition conditions

2.5 4 种浓度N 营养对水稻植株内一些C、N 代谢关键基因表达的影响

为了探究水稻植株对N 营养浓度变化响应的分子机制，我们进一步分析苗期水稻植株内一些C、N代谢关键基因对4 种N 浓度的表达响应。首先是4个硝态 N 转运关键基因，包括OsNRT2.1（Os02g02170）、OsNRT2.2（Os02g02190）、OsNAR2.1a（Os02g38230）和OsNAR2.1b（Os04g40410）。其中，OsNRT2.1和OsNRT2.2硝态氮转运关键基因，是硝态氮高亲和基因，而OsNAR2.1a 和OsNAR2.1b与OsNRT2.1 和OsNRT2.2 蛋白互作，促进硝态氮吸收和转运，因此也参与硝态氮吸收和转运。有意思的是，OsNRT2.1和OsNRT2.2是串联重复同源基因（图 4（a））；这些基因的表达均受硝态氮诱导[9-10]。OsNIA1和OsNIA2是水稻中重要的硝酸还原酶编码基因，OsASN1编码参与天冬酰胺 （asparagine）合成代谢的关键酶[11]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）催化磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoeno lpyruvate）和HCO3-生成草酰乙酸和无机磷酸的不可逆反应，参与植物光合碳同化等重要代谢。在植物，尤其是叶片组织细胞中，PEPC 编码基因受到多种因素调控，从而直接影响碳同化效率。在C3 植物中，PEPC 为Lrebs 物质循环补充四碳二羧酸从而调节回补反应。水稻中共有5个PEPC编码基因（Osppc1、Osppc2a、Osppc2b、Osppc3和Osppc4）, 这些PEPC 酶均位于叶绿体，其中Osppc4 是叶肉细胞中主要的PEPC 酶[12]。

图4 4 种N 浓度处理后水稻植株4 个硝态氮转运关键基因在根部的表达响应Figure 4 Expression response of 4 key nitrate N transport genes in root to 4 different N nutrition conditions

我们对30 d 左右的日本晴植株用上述4 种N 浓度营养液处理1 h 后，进行荧光实时定量PCR（qRT-PCR）分析基因表达。可以看出，只有OsNRT2.1在0.5 mmol·L-1N 营养条件下表达显著上调，上调幅度为1～3 倍。而其他N 浓度处理则没有显著的表达变化（图 4（a）和（b））；有意思的是，OsNIA1、OsNIA2、OsASN1和OcPPC4个氮代谢关键基因在根部或叶片的表达响应并不显著（图 5）。

图5 4 种N 浓度处理后水稻植株4 个氮代谢关键基因在根部或叶片的表达响应Figure 5 Expression response of 4 key N metabolism genes in root or leaf to 4 different N nutrition conditions

3 讨论与结论

本研究系统分析全生育期内不同N营养条件对水稻植株生物和发育的影响效果。可以看出，外施N 肥对蔗糖代谢和转运（光合碳同化）、氨基酸代谢及叶绿素合成代谢均有重要的影响。首先，蔗糖代谢和转运（光合碳同化）、叶绿素合成代谢，植株籽粒产量和结实率等性状之间表现非常一致的变化趋势，即在相对正常的N 营养浓度（0.5 和2 mmol·L-1）条件下，这些性状均表现最大值。然而，水稻植株氨基酸代谢与外施N 营养浓度始终是成正比，这表明氨基酸代谢与蔗糖代谢和转运（光合同化作用）及色素合成代谢有不同的调控机制和调控途径。

孟亚利等[12]在水稻地上部干物质分配动态模拟的研究中发现环境因素中N 供应水平对色素分配指数的影响最大, 水稻株体内N 水平高, 分配给形成叶的同化物比例也大。王月福等[13]在施氮量对小麦耔粒蛋白质组分含量及加工品质影响的研究表明，增施氮肥能够显著提高籽粒蛋白质各组分的含量，但各组分含量提高的幅度存在差异。本研究表明，水稻植株生长发育有一个比较狭窄的适宜N 营养浓度范围。综合来看，2 mmol·L-1N 是最适宜水稻生长发育的N 营养浓度条件。这个结论对指导水稻农业生产具有重要的应用价值，也清楚地表明，过度施N 肥不仅不能提高作物产量，反而导致水稻生长发育抑制，生育期延长，结实率降低等不利农艺性状特点。

本研究结果将为后续深入探究N 营养对水稻生长发育和C、N代谢的相关分子机制提供了前期基础。