基于网络药理学黄精抗炎活性成分及作用机制研究

许 慧，代 磊，邓鹏飞，徐小牛

(安徽农业大学林学与园林学院，合肥 230036)

黄精（Polygonati rhizoma）是百合科（Liliaceae）黄精属（PolygonatumMILL.）多年生草本植物，通常生长在山坡背阴处的林灌木之下，为喜阴植物，又名老虎姜、鸡头参。其块茎含有多糖、黄酮类化合物、生物碱、强心苷、木质素、维生素和氨基酸等化学成分，具有提高免疫、抗氧化、延缓衰老、抗炎、抗肿瘤等多种功效[1]。炎症是一种十分复杂的宿主反应，是人体十分常见的而又重要的基本病理原理，体表的外伤感染和各器官的大部分常见病和多发病都属于炎症性疾病[2]。关于黄精抗炎作用，很多学者已进行深入研究[3-5]，主要研究方向集中在黄精块茎提取物的整体药效上。Xian 等[6]发现黄精水提取物能显著抑制NO 合酶、肿瘤坏死因子-a）、IL-1P（白细胞介素-1p）、环氧化酶-2）和IL-6 的mRNA和蛋白表达水平，最终降低炎症反应。李玲[7]发现多糖能抑制小鼠脾淋巴细胞体外分泌TNF-α，具有一定抑制炎症的作用，可以促进细胞分泌INF-γ，提高细胞免疫力。而利用大数据挖掘和分析黄精抗炎潜在靶标及作用机制研究尚少。中药发挥药效具有多成分-多靶点-多通路的特征，中药网络药理学结合了植物化学、药理学和生物信息学技术，可以很好地解释药物、靶标、信号通路与疾病之间的关系[8-9]。本研究运用网络药理学理论，以黄精为研究对象，探究黄精治疗炎症的作用机制，为科学研究黄精活性成分及进一步的调控研究提供思路。

1 材料与方法

1.1 黄精化学成分库的建立

借助中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[10]检索黄精化学成分，建立黄精化学成分数据库。口服生物利用度（OB）和类药性（DL）分别表征药物被吸收进入人体循环的速度与程度、化合物与已知药物的相似性，常根据OB ≥ 30%、DL≥ 0.18 筛选黄精活性成分[11]。

1.2 化合物靶点筛选

将在TCMSP 数据库中筛选出的化合物上传至Pharmmapper 数据库，获取每种成分对应的靶点蛋白，整理在Excel 中。借助Uniprot 数据库，获取活性化合物的潜在靶点基因。

1.3 疾病靶点筛选

GeneCards 数据库和MalaCards 数据包含了大量疾病的基因，用炎症英文名“Inflammation”进行检索，下载搜索结果保存在Excel 中，建立人体所有的抗炎相关基因库。将活性化合物的潜在靶点基因与炎症基因库在Excel 中对照去重，得到黄精活性成分抗炎潜在靶点。

1.4 蛋白质互作(PPI)网络的构建及核心基因分析

STRING 数据库可以分析已知靶点和预测靶点之间的相互作用，将黄精抗炎潜在靶点上传至该数据库，物种选择“人类”，设置confidence score ＞ 0.4,构建PPI 网络图。利用Cytoscape 软件对PPI 网络进行拓扑分析，根据“中介中心性”排列，筛选核心基因。

1.5 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析

Metascape 数据库是一个功能强大的基因功能注释工具，将黄精抗炎潜在靶点导入该数据库，选择Homo sapiens，设置P Value Cutoff 为0.01，Min Overlap 为3，Min Enrichment 为1.5，筛选出前20个条目，分别进行GO 和KEGG 富集分析。借助微生信在线平台（http：//www.bioinformatics.com.cn）和Excel 软件对数据进行可视化处理，以阐明黄精抗炎的生物功能及相关信号通路。

1.6 构建“成分-靶点-通路”网络

为进一步探索化合物与靶点和信号通路之间的关系，将活性成分和靶点基因和富集通路导入Cytoscape3.6.1 软件中，分别构建成分-靶点基因网络图和靶点基因-富集通路网络。使用Merge 功能，构建“成分-靶点-通路”网络图。

2 结果与分析

2.1 活性成分筛选

从TCMSP 数据库中一共搜索到38 中黄精化学成分，通过（OB）≥30%，（DL）≥0.18 值共筛选出12 个活性成分，结果见表1。其中薯蓣皂苷元和(2R)-7-羟基-2-(4-羟苯基)-4-苯丙二氢呋喃具有较高的生物利用度，甲基原薯蓣皂甙和西伯利亚蓼苷具有较高的类药性。

表1 黄精潜在有效成分Table 1 Potential active components of Polygonati rhizoma

2.2 潜在靶点筛选

将炎症靶点和化合物靶点在Excel 中进行对照筛重后，一共得到65 个活性成分潜在抗炎靶点基因，结果见表2。

表2 黄精潜在抗炎基因Table 2 Potential anti-inflammatory genes in Polygonati rhizoma

2.3 PPI 网络

为了探讨黄精的成分靶点与炎症靶点在蛋白水平上的作用机制，将65 个共同靶点导入STRING数据库绘制PPI 网络，在置信度confidence score ＞0.4 条件下，去除游离点，共得到61 个节点（图1），根据Degree 值排序，排名靠前5 个核心靶点，分别是ALB、EGFR、MAPK1、CASP3 和ESR1，上述靶点可能是黄精抗炎的重要靶点。

图1 黄精化学成分与疾病共有靶点的PPI 网络图Figure 1 PPI network diagram of common targets of chemical components and diseases of Polygonati rhizoma

2.4 靶点功能与通路注释

将共同靶标导入Metascape 数据库中进行GO富集和KEGG 通路注释。结果显示，在P＜0.01 条件下，细胞组成（cellular component，CC）11 个，主要有囊泡腔、血微粒、空泡腔、局灶性粘附、血小板α 颗粒等。分子功能（molecular function，MF）15 个，主要有甾体结合、核受体活性、蛋白激酶活性、激素结合、MAP 激酶活性、蛋白激酶结合、内肽酶活性、单羧酸结合、蛋白结构域特异性结合、跨膜受体蛋白激酶活性等。生物过程（biological process，BP）20 个，主要有细胞对有机环化合物的反应、类固醇代谢过程、对雌激素的反应、对脂多糖的反应、上皮细胞增殖、激酶活性的正调节、炎症反应的调节、胞吐的调节、对氮化合物的反应、对无机物的反应等。对主要条目进行可视化处理，结果见图2。KEGG 通路富集结果显示，黄精抗炎可能参与的通道有13 条，主要有肿瘤、前列腺癌、IL-17 信号转导途径、乙型肝炎、金黄色葡萄球菌感染等。进行可视化分析，结果见图3。

图2 黄精抗炎潜在靶点GO 生物功能分析Figure 2 Biological function analysis of GO, a potential anti-inflammatory target of Polygonati rhizoma

图3 黄精抗炎潜在靶点KEGG 分析Figure 3 KEGG analysis of potential anti-inflammatory targets of Polygonati rhizoma

2.5 黄精抗炎活性成分-核心靶点-通路网络图

应用Cytoscape 3.7.0 软件，绘制黄精活性成分-核心靶点-通路网络（图4），其中选择前10 条通路进行绘制。网络图中共有87 个节点（包括12 个化合物、65 个靶点和10 条通路）和303 个边条。圆形代表化合物，节点平均度为15.25，大于成分节点度的节点有6 个，分别为(+)-丁香树脂醇-O-β-D-葡萄糖苷、中华在线1、甲基原纤细薯蓣皂苷、西伯利亚蓼苷A、3’-甲氧基大豆苷元和β-谷甾醇。菱形代表靶点基因，节点平均度为2.82，大于靶标节点的有28 个。正方形代表炎症发生可能涉及的通路，平均节点度为 12，大于成分节点度的通路有Pathways in cancer（癌症的途径）、Prostate cancer（前列腺癌）、IL-17 signaling pathway（IL-17 信号通路）、Hepatitis B（乙型肝炎），可能是黄精治疗炎症的关键通路。

图4 成分-潜在靶标-信号通路网络图Figure 4 Network diagram of component-potential target-signaling pathway

3 讨论与结论

在知网以“黄精”为关键词，检索2000 至2020年发表的文献，经过筛选整理，有关黄精抗炎的药效作用已有报道[12-13]，但黄精主要活性成分抗炎作用网络药理学研究尚鲜见报道。炎症是一个严格控制的过程，对宿主抵抗感染至关重要。急性炎症载体起到正向辅助作用，有助于固定受伤的区域，慢性炎症则相反，慢性炎症组织通常会通过血液激活免疫细胞，进而增强炎症反应[14-15]，从而导致许多常见的疾病，如败血症、关节炎、哮喘、癌症和糖尿病。因此研究黄精主要活性成分的抗炎机制具有重要作用。

关于黄精块茎化学成分，很多学者进行了研究，其中甾体皂苷类、糖类和甾醇类化合物一直是研究热点。张翠等[16]发现用不同剂量的泰山黄精水煎剂二甲苯诱发耳肿胀小鼠，证实泰山黄精具有抗炎作用。由“活性成分-靶点-通路”网络图得知(+)-丁香树脂醇-O-β-D-葡萄糖苷、中华在线1、甲基原薯蓣皂甙、西伯利亚蓼苷A、3’-甲氧基大豆苷元和β-谷甾醇6 个成分与靶点连接度最高，可能是黄精抗炎的核心成分。其中(+)-丁香树脂醇-O-β-D-葡萄糖苷和3’-甲氧基大豆苷元属于黄酮类化合物，中华在线1、甲基原纤细薯蓣皂苷和西伯利亚蓼苷A，β-谷甾醇属于甾体皂苷类化合物。黄酮类和甾体皂苷类化合物是重要的天然产物，具有降血糖、抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性[17-20]。李丽红等[21]对玉竹提取物3 个高异黄酮类进行人白细胞弹性蛋白酶(HLE)抑制作用测试，证明了3 个高异黄酮类化合物均具有较好的抗炎活性。β-谷甾醇是植物中常见的甾醇，Liao 等[22]发现β-谷甾醇可通过抑制表皮细胞、巨噬细胞中炎症小体NLRP3 的激活来抑制CAS1 的产生及MAPK 信号通路的活化，使得细胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8 生成显著减少从而起到抗炎作用。综上，黄精可能通过这6 种活性成分起到抗炎作用。

PPI 蛋白互作网络分析中，ALB、EGFR、MAPK1、CASP3和ESR1这5 种基因所对应的功能蛋白相互联系最为紧密，很可能为黄精抗炎的核心靶基因。ALB 是一种肝脏特异性蛋白，是反应患者肝细胞的敏感指标。夏晓寒等[23]展开ALBmRNA对乙型肝炎肝硬化患者血浆中的表达，观察组中ALBmRNA 的表达显著高于对照组，说明ALBmRNA对肝硬化患者的临床诊断及预后具有重要意义。表皮生长因子受体(EGFR)是一种受体酪氨酸激酶，结合表皮生长因子，从而诱导受体二聚化和酪氨酸自磷酸化，导致细胞增殖[24]。有研究证明，去整合素-金属蛋白酶17 驱动EGFR 信号传导，通过下游磷脂酶C-γ/蛋白激酶C 途径诱导转谷氨酰胺酶1 表达，增加KC 中的TG1 活性，有助于降低特异性皮炎的发生[25-26]。丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)又称为细胞外信号调节激酶2，MAPK1 途径可以通过磷酸化转录因子改变基因表达，促进炎症因子(TNF-α、IL-1、IL-6 等)的产生[27]。CASP3（胱天蛋白酶3）在细胞凋亡的执行阶段起着重要作用，参与细胞凋亡、坏死和炎症的信号转导，负责凋亡执行的胱天蛋白酶的激活级联反应，诱导细胞发生凋亡[28]。张璐璐[29]通过网络药理学证明，柚皮素和木犀草素进入人体后，通过调节包括PTGS2、NOS2、RELA、BCL2 和CASP3 等在内的多种蛋白的活性参与多种信号传导来治疗慢性胃炎，并通过体外实验进行了验证。雌激素受体1（ESR1）是一种核转录因子，雌激素的表达和炎症是诊断炎症反应的重要指标，炎症存在时可显著升高[30]。

GO 富集分析得出黄精可以通过类固醇代谢、细胞对有机环化合物的反应及炎症反应的调节等生物过程起调控作用，涉及囊泡腔、血微粒、空泡腔等，通过与甾体结合、核受体活性、蛋白激酶活性等分子功能产生活性。KEGG 分析结果显示，黄精抗炎作用与Pathways in cancer（癌症的途径）、Prostate cancer（前列腺癌）、IL-17 signaling pathway（IL-17 信号通路）、Hepatitis B（乙型肝炎）等显著相关。其中IL-17 信号通路上富集的潜在靶点最多，IL-17 是由Th17 细胞分泌的促炎因子，主要是通过其介导的信号通路来发挥效应[31]。

综上，本研究运用网络药理学的方法对黄精抗炎作用的潜在靶点及机制进行了预测，充分体现了黄精是通过多成分、多靶点、多通路发挥抗炎作用，这将为进一步开展黄精抗炎机制研究和后续研究提供依据。