江苏部分集约化养殖场肉羊隐孢子虫分子流行病学调查及其虫种鉴定

蔡源，曹思宇，2，成大荣，3*，邢华，3*

（1．扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；2．江都区小纪镇人民政府，江苏扬州 225009；3．江苏高校动物重要疫病与人畜共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009）

隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种经粪-口途径传播 的人畜共患寄生虫，是导致腹泻的4种病原体之一[1]。隐孢子虫可通过人与动物的直接接触或摄入污染的食物和水传播[2]，感染宿主范围广泛，包括人、牛、羊、啮齿类及马科动物等[3]。隐孢子虫可引起免疫力低下的羔羊和犊牛出现长期腹泻，影响动物的生长发育，甚至危及生命[4]。

目前已知的隐孢子虫有38种，感染羊的隐孢子虫有微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）、泛在隐孢子虫（Cryptosporidium ubiquitous）、安氏隐孢 子虫（Cryptosporidium andersoni）、费 氏隐 孢 子虫（Cryptosporidium fayeri）、肖氏隐孢子虫（Cryptosporidium xiaoi）、牛隐孢子虫（Cryptosporidium bovis）、猪隐孢子虫（Cryptosporidium suis）和人隐孢子虫（Cryptosporidium hominis）等8种[5]。本研究通过采集部分集约化养殖场的肉羊粪便样品，以分子生物学技术调查隐孢子虫的感染现状，为该地区肉羊隐孢子虫病的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源

在江苏省8个地区的肉羊养殖基地采集6～12月龄肉羊的新鲜粪便样品，共采集446份样品，其中腹泻羊样品168份，健康羊样品278份，4℃冷藏保存。

1.2 试剂与仪器

粪便基因组DNA快速提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司产品）、Premix Taq（TaKaRa Taq version 2.0 plus dye）、DL 2 000 DNA Marker（TaKaRa公司）。

BIO-RAD凝胶成像仪、T100™thermal cycler PCR仪、Power Pac basic电泳仪（BIO-RAD公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 山羊粪便基因组DNA提取按照粪便基因组DNA快速提取试剂盒说明书的操作步骤，提取粪便样品的DNA。

1.3.2 引物合成（见表1）

参照张龙现等[6]报道的隐孢子虫18S rRNA基因设计的引物进行巢式PCR扩增，引物由华大基因合成，引物信息见表1。

表1 巢式PCR扩增隐孢子虫引物信息Tab.1 PCR amplification of Cryptosporidium primers

1.3.3 隐孢子虫的流行病学调查

运用巢式PCR的方法，基于18S rRNA基因引物对隐孢子虫进行扩增，目的片段约为830 bp。

反应体系：Premix TaqTM 12.5 μL、F1 1 μL、F2 1 μL、DNA模板1 μL，加ddH2O补至25 μL。

PCR反应条件见图1。

图1 隐孢子虫18S rRNA基因位点PCR反应条件Fig.1 PCR reaction condition of 18S rRNA gene of Cryptosporidium

取5 μL第二轮PCR扩增产物在琼脂糖凝胶孔中电泳，以DL 2000 DNA Marker为参照，采用凝胶成像系统采集拍照，记录阳性感染情况。

1.3.4 隐孢子虫卵囊形态观察

将1.3.3巢式PCR筛选出的阳性粪样，经260目网筛过滤，滤液以3 000 r/min离心10 min，收集沉淀。采用改良抗酸染色法镜检：取少许沉淀液涂片，空气中自然干燥后采用甲醛固定；干燥后滴加苯酚品红染液，10 min后缓慢冲洗；再滴加10%硫酸溶液脱色10 min，缓慢冲洗；最后滴加孔雀绿溶液复染8 min，冲洗干燥后镜检。

1.3.5 隐孢子虫虫种鉴定

使用DNA胶回收试剂盒对巢式PCR阳性条带进行回收，送至通用生物系统有限公司，进行双向测序。将样品测序得到的结果在GenBank上用BLAST搜索比对校正，并将检测所得的参考序列用DNAStar软件进行分析，确定分离的隐孢子虫种类型。

2 结果与分析

2.1 肉羊隐孢子虫感染情况（见图2）

图2 隐孢子虫18S rRNA基因PCR扩增部分结果Fig.2 Results of PCR amplification of Cryptosporidium 18S rRNA gene

由图2可知，经巢式PCR检测，446份样品中有20份在18S rRNA基团位点扩增出大小约为830 bp的目的条带。结果显示，被检样品的隐孢子虫总感染率为4.48%（20/446），其中健康羊粪样的阳性检出率为2.28%（8/278），腹泻羊检出率为7.14%（12/168）。

2.2 不同地区肉羊隐孢子虫的感染情况（见表2）

由表2可知，灌云、海门、高邮和启东隐孢子感染率分别为6.25%、4.83%、22.42%和2.56%，淮安市、常州市、徐州市和泰州市4地采集的样品中均未检出隐孢子虫。

表2 不同地区肉羊隐孢子虫感染情况Tab.2 Cryptosporidium infection of mutton goat in different areas

2.3 不同肉羊品种隐孢子虫的感染情况（见表3）

由表3可知，3种不同的肉羊品种隐孢子虫的感染率也不相同，其中，睢宁白山羊和波尔山羊的隐孢子虫感染率分别为6.83%和5.83%，小尾寒羊暂时未发现隐孢子虫的感染。

表3 不同肉羊品种隐孢子虫的感染情况Tab.3 Infection of Cryptosporidium in different mutton sheep breeds

2.4 隐孢子虫卵囊形态鉴定结果（见图3）

图3 检测的隐孢子虫卵囊Fig.3 Detection of Cryptosporidium oocysts

由图3可知，经改良抗酸染色法染色后的隐孢子虫卵囊在油镜下观察，呈深玫瑰红色，背景为蓝绿色，卵囊壁轮廓清晰不着色，卵囊呈卵圆形或圆形，大小为5～6 μm，符合隐孢子虫的形态特征。

2.5 被检样品虫种鉴定结果（见表4）

由表4可知，20份隐孢子虫核酸阳性样品，经测序分析后共发现2种隐孢子虫虫种，分别为微小隐孢子虫和泛在隐孢子虫。其中灌云为泛在隐孢子虫；高邮和启东均为微小隐孢子虫；海门既有泛在隐孢子虫又有微小隐孢子虫。将测得基因在Genbank上用Blast比对，均可匹配到同源性100%的虫种序列。

表4 被检样品虫种鉴定结果Tab.4 Species types of Cryptosporidium in tested samples

3 讨论

隐孢子虫病是一种宿主范围广泛的人畜共患寄生虫病[7]，被WTO列为人类最常见的6种腹泻病之一[8]。隐孢子虫病可引起人和动物的胃肠道紊乱，导致腹泻、发热、消瘦、呕吐以及生长发育缓慢等临床症状，对肉羊舍饲造成了巨大损失[9-10]。由于隐孢子虫病尚无特效药物治疗和有效的疫苗预防，故做好隐孢子虫病的早期诊断对其防控具有重要的公共卫生意义。本试验采用巢式PCR方法，辅以抗酸染色法，对江苏部分地区规模化养殖场进行了肉羊隐孢子虫流行病学调查，以期为此病的防控工作提供参考。

本次试验基于18S rRNA以巢式PCR法检测粪便样品，隐孢子虫总感染率为4.48%，鉴定出微小隐孢子虫和泛在隐孢子虫2种隐孢子虫，泛在隐孢子虫阳性率为2.47%（12/446），微小隐孢子虫阳性率为2.02%（8/446），两者感染率接近。因此，分析认为江苏地区存在隐孢子虫的感染，其中灌云、海门、高邮和启东隐孢子感染率分别为6.25%、4.83%、22.42%和2.56%，提示肉羊隐孢子虫病流行情况可能存在着地区差异性。经分析，地方品种小尾寒羊和睢宁白山羊的感染率和外来品种波尔山羊差异不大，提示隐孢子虫感染率的差异可能与肉羊的饲养管理、品种、诊断方法、驱虫程序、样品采集等有关[11]。

本次调查采样中腹泻羊样品感染率为7.14%，健康羊样品感染率为2.28%，可能与动物的机体抵抗力有关。随着养殖场规模化养殖的普及以及开展科学有效的寄生虫防控措施，降低了动物重复感染的概率。本次调查的羊群年龄未6～12月龄，营养状况较好，感染率较低。有研究认为，分娩前后母羊和2～3月龄羔羊感染率较高，表明肉羊隐孢子虫病的感染与动物的年龄、免疫情况以及机体的营养水平有关[12]。

隐孢子虫主要经过水源传播，通过摄入被隐孢子虫卵囊污染的水感染人或动物。养殖场应加强预防，注意饲养管理，保持环境卫生，对圈舍进行定期消毒，保持圈舍干燥干净，做好粪便处理工作，避免污染水源[13]。隐孢子虫卵囊对环境和消毒剂的抵抗力很强，可采用50%氨水5 min，30%过氧化氢30 min，10%甲醛120 min对所有物体及其表面进行蒸汽消毒[14]。此外，日常可采用增强动物机体免疫力的保守治疗方法，采用煮沸1 min以上的方法及滤孔直径不超过1 μm的家用净水器可确保饮水安全[15]。

目前对隐孢子虫感染尚无完全有效的治疗方法，本试验运用的隐孢子虫巢式PCR检测方法不仅增加了普通PCR的特异性，而且比普通PCR反应更敏感，重复性更好，可应用于临床样品的检测。

4 结论

通过对江苏省不同地区肉羊养殖场隐孢子虫的流行病学调查发现，肉羊养殖场存在隐孢子虫的感染，检测到的2种病原均为人畜共患病原，不仅会造成肉羊经济的损失，对公共卫生也具有潜在威胁。因此，肉羊场隐孢子虫病的防控仍需持续加强。