基础成熟液和卵巢保存温度对牛体外胚胎发育的影响

黄承俊，赵刚，李宁，杜学海，张文军

（辽宁省农业发展服务中心，辽宁沈阳 110032）

卵母细胞的体外成熟是体外受精和体外胚胎发育的基础，与之后的受精率和囊胚发育率直接相关，是体外胚胎生产中最为关键的一步。为进一步提高牛卵母细胞的体外成熟技术，已有学者从激素[1]、微量元素[2]、生长因子[3]、培养模式[4]等方面进行了大量研究，但在基础液的选择与使用上仍较为单一[1-4]。试剂A是一种同时可应用于卵母细胞体外成熟和细胞培养的基础液，尚未见相关报道。卵母细胞在体外成熟时是卵丘-卵母细胞共培养状态，有研究表明，卵母细胞的成熟质量与卵丘细胞发育的良好程度具有一定关联[5-6]。因此，利用试剂A进行牛卵母细胞的体外成熟，或许能够同时促进卵丘细胞和卵母细胞的发育，进而获得一定的体外胚胎发育效果。

此外，因从屠宰场获取限定条件下的试验材料难度较大，为方便试验或生产，也有研究探索了不同卵巢保存温度在牛体外胚胎发育方面的影响[7-10]，结论虽不完全一致，但均表明一定范围内，不同卵巢保存温度会对牛体外胚胎生产造成一定影响。因此，在仅进行体外胚胎生产且不做其他因素考虑时，可对卵巢采用非限定温度的保存方式。关于牛卵巢的常温保存少有报道，但已有研究表明猪卵巢的常温保存仍具良好的试验效果[11-12]。研究对试剂A和卵巢常温保存体外培养进行了相关试验，以期为相关研究及生产应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用卵巢采集自沈阳市沈北新区某个体屠宰场。

试剂除试剂A、试剂B、M199（赛默飞世尔科技）、IVF-100受精液（Research Institute for the Functional Peptides）、胎牛血清（FBS，南京森贝伽生物有限公司）以及卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH，宁波三生制药）外，均购自Sigma公司。

HERAcell®150 i CO2培养箱、单人超净工作台（苏州净化设备有限公司）；水浴锅（常州迈科诺仪器有限公司）、恒温加热台（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、电子天平（赛多利斯公司）、5702离心机（eppendorf公司）。

1.2 卵母细胞的采集

无菌手术剪刀去除卵巢周围多余组织，含双抗的37℃生理盐水清洗5～6遍。取单个卵巢，吸取表面多余水分，以带9号针头的10 mL无菌注射器抽取表面直径为2～8 mm卵泡的卵泡液于直径120 mm的细菌培养皿。采卵液为M199+5% FBS+30 mg/L肝素钠+4.766 g/L Hepes缓冲剂。每抽取5～6个卵巢捡卵一次，挑选具有3层以上卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）用于体外成熟。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计

1.3.1 .1不同试剂对牛体外胚胎发育的影响

分别选用试剂A和试剂B作为基础成熟液进行牛卵母细胞的体外成熟。添加成分均为10%FBS、0.01 IU/mL FSH、0.02 IU/mL LH和1 mg/L雌二醇（E2）。卵巢保存条件均为37℃加双抗生理盐水的保温杯。

1.3.1 .2卵巢常温保存对牛体外胚胎发育的影响

分别采用常温（空气温度测定值为23℃）及37℃加双抗生理盐水的保温杯进行卵巢保存。运输时间均为1 h以内，卵母细胞体外成熟所使用的液体均为试剂B。

1.3.2 体外成熟

每捡完一次卵，将挑选的COCs于成熟液中洗3遍，之后每40个左右移入平衡至少2 h的成熟液中进行卵母细胞的体外成熟。成熟方法为四孔板法，成熟条件为38.5℃、5%CO2的饱和湿度，培养时间为22～24 h。

1.3.3 精子的洗涤

细管冻精在37℃水浴锅中解冻后，置于含6 mL受精液的离心管中，2 000 r/min离心7 min，弃去上清液后重复洗涤1次。洗涤好的精子采用受精液稀释至密度为1×106～6×106个/mL，于CO2培养箱中培养10 min。

1.3.4 体外受精

卵母细胞体外成熟22～24 h，受精液中洗3遍，10枚/组移入平衡至少2 h的50µL受精微滴中，加入50µL的洗涤后备用精子，于CO2培养箱中进行体外受精。受精条件为38.5℃、5%CO2的饱和湿度，受精时间为6 h。

1.3.5 体外培养

体外受精5～6 h，将假定的受精卵于胚胎培养液CR1aa[13]中洗3遍，1 mL移液枪去除周围部分卵丘细胞及精子，受精卵10枚/组移入平衡至少2 h的含100µL培养液的微滴中进行体外培养。培养条件为38.5℃、5%CO2的饱和湿度。从体外受精开始算起，第48 h观察卵裂率，第7～8 d统计囊胚发育率，中途不换液。每组试验重复3次。

1.4 数据统计与分析

试验数据用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析，LSD、Duncan's法进行双侧检验，非齐性采用Dunnett's C进行检验。结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同试剂对牛体外胚胎发育的影响（见表1）

由表1可知，试剂A的卵裂率与试剂B相比差异不显著（P＞0.05），但囊胚率显著低于试剂B（P＜0.05）。

表1 不同试剂对牛体外胚胎发育的影响Tab.1 Effect of different reagent on bovine embryo production in vitro

2.2 不同卵巢保存温度对牛体外胚胎发育的影响（见表2）

由表2可知，常温（23℃）保存条件下的卵裂率与37℃条件保存下的卵裂率差异不显著（P＞0.05），但囊胚率显著低于37℃保存条件（P＜0.05）。

表2 不同卵巢保存温度对牛体外胚胎发育的影响Tab.2 Effect of different ovarian storage temperatures on bovine embryonic development in vitro

3 讨论

3.1 不同试剂对牛体外胚胎发育的影响

本试验结果显示，试剂A获得了19.04%的囊胚率，表明试剂A也可应用于牛体外胚胎生产体系的建设。试剂A是一种主要应用于细胞分离及培养的基础液，但也具有应用于卵母细胞体外成熟基础试剂的效果。本试验中试剂A的卵裂率与试剂B差异不显著，但囊胚发育率却显著降低，可能由于试剂A与常用的牛卵母细胞体外基础成熟液相比，添加的是氨基酸成分，缺少了部分利于卵母细胞体外成熟的因子，进而影响卵母细胞体外成熟的质量以及胚胎的后续发育。牛卵母细胞体外成熟的质量与后续受精卵的发育具有直接的关联性，与本研究结论一致[5-6]。

此外，试剂A是一种可用于细胞培养和卵母细胞体外成熟的液体，而卵母细胞的体外成熟通常是卵丘-卵母细胞复合体的形式。颗粒细胞单层有助于牛卵母细胞的体外成熟，而培养的细胞具备上述功能主要通过卵丘-卵母细胞连接通道进行[6]。本试验中试剂A有助于卵丘细胞的发育，原因可能是该功能进一步促进了卵母细胞的体外成熟。但试剂A的囊胚率及胚胎的后续发育均不如试剂B，间接表明了细胞共培养有助于卵母细胞体外成熟质量的提升，但并非关键因素。综上所述，试剂A也可应用于牛体外胚胎生产体系的建立，但效果有待进一步提高。

3.2 常温保存对牛体外胚胎生产体系的影响

牛卵巢的保存温度与运输时间有关，一般运输时间在4 h内时，保存温度为37℃，运输时间越长，相对的保存时间越低。为研究常温保存下的胚胎生产效果，试验选择37℃保存条件做对照，结果显示，常温保存获得了21.75%的囊胚率，表明牛卵巢常温保存可实现体外胚胎生产。但与37℃保存条件相比，常温保存的囊胚率显著降低，表明卵巢的保存温度可显著影响体外胚胎的后续发育。因常温保存存在温度不确定性，故仅建议常温保存应用于一定条件下的体外胚胎生产，不建议应用于其他因素的分析。

本试验显示，卵巢的常温保存与37℃保存的卵裂率差异不显著，表明温度对体外胚胎生产的表面影响主要在卵裂后期，与前人结论一致[7-8]。卵巢是卵母细胞的载体，温度对卵巢的影响即为对卵母细胞的影响。但无论卵巢保存在4、10℃[9-10]，还是20～25、30～38℃[7-9]，其成熟率和卵裂率均不低，且可获得一定的囊胚率，表明卵巢保存温度并非牛体外胚胎生产的决定性因素。目前研究的温度范围内，卵母细胞均具有一定的承受能力，故在只考虑生产牛体外胚胎不做其他因素考虑的情况下，可采用常温保存的便捷方式获取试验材料。

4 结论

试剂A可应用于牛体外胚胎的生产，但囊胚率低于试剂B。牛卵巢采集可在常温下进行，但温度对受精卵的后续发育影响较大，进行对比试验时需考虑该因素的影响。