中老年慢性宫颈炎伴HPV感染阴道菌群变化与血清T细胞亚群和炎性因子的相关性

李晓焱 臧学利 马艳

(安徽省淮北矿工总医院妇产科，安徽 淮北 235000)

慢性宫颈炎是临床常见的妇科疾病之一，会导致阴道分泌物增多，月经不调等症状，且缠绵难愈、复发性高〔1〕。人乳头瘤病毒(HPV)是一种乳头瘤空泡病毒A属，属于球形DNA病毒，能够引起患者人体皮肤黏膜上的鳞状上皮增殖〔2〕。90%以上的妇女在感染HPV后可通过自身免疫力清除病毒，5%～10%的妇女只能抑制病毒复制生长，无法完全清除病毒，成为潜伏感染，虽然不会有细胞学改变，但会维持高水平HPV病毒载量，成为持续感染〔3〕。高危型HPV是宫颈癌病变的主要危险因素，因此慢性宫颈炎合并HPV感染是宫颈癌高危因素之一。为了抵抗外部病原菌感染、抑制机体炎症反应，女性阴道的微生态系统包括阴道生理性结构、阴道菌群、免疫系统〔4〕。阴道菌群是重要生物屏障，能够维持阴道正常菌群构成和微生态平衡。宫颈直接暴露在阴道内，时刻受到阴道内环境的影响，当阴道内环境平衡破坏时，会增加HPV感染机会，促进HPV发展成癌症的可能。人体对HPV感染的第一道防线为免疫系统的黏膜表面，阴道黏膜表面的细胞免疫是阴道局部免疫的重要内容，也是机体免疫功能的一部分，其中T细胞亚群是阴道局部细胞免疫的主要效应细胞〔5〕。有研究显示，高危型HPV感染虽然是宫颈病变的初始因素，但其进一步发生发展还需与其他因素发挥协同刺激作用，其中外阴和阴道炎症是常见的协同因素之一〔6〕。本研究拟分析慢性宫颈炎伴HPV感染患者阴道菌群变化及血清T细胞亚群和炎性因子的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月至2021年1月于安徽省淮北矿工总医院诊治的81例慢性宫颈炎伴HPV感染中老年患者为观察组，另选取HPV阴性的中老年慢性宫颈炎患者60例为对照组。纳入标准：①符合《妇产科学(第8版)》〔7〕中慢性宫颈炎诊断标准，其中观察组经HPV检测、TCT检测和阴道镜活检确诊为HPV感染；②有性生活史，入组时非妊娠期、月经期及哺乳期者；③取材前72 h内无性生活、无妇科检查、无阴道冲洗及用药者；④年龄>40岁；⑤患者精神状态良好，配合检查并签署知情同意书。排除标准：①合并盆腔创伤、宫颈手术史或恶性肿瘤者；②合并感染性、免疫性疾病或营养不良者；③合并心脑血管疾病等严重内科疾病、肝肾功能损伤者；④有免疫抑制剂或激活剂用药史者；⑤已进行全身或局部治疗者。两组年龄、病程、病变类型、病情分级比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组临床资料比较

1.2方法 两组均应用无菌窥器暴露宫颈阴道部，使用棉拭子刮取部分阴道内侧分泌物于试管中，后续用于阴道微生态检测。抽取清晨空腹肘静脉血5 ml，离心后留取血清，后续用于宫颈T淋巴细胞亚群和炎性因子检测。采用酶化学法检测阴道微生态，包括pH、过氧化氢、白细胞酯酶、唾液酸苷酶、β-葡萄糖醛酸糖苷酶、凝固酶。并检测滴虫、霉菌、支原体、衣原体、孢子和假菌丝等阴道菌群分布情况〔8〕。所得标本液经3 000 r/min离心10 min，收集下层细胞并置于抗凝试管，使用FACSCalibur型流式细胞仪(美国Brctond-Dickinson公司)测定T细胞亚群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)水平，采用酶联免疫吸附试验检测炎性因子〔干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-2、IL-4〕水平，试剂盒购自武汉默沙东生物科技有限公司，检测步骤根据试剂盒说明书进行〔9〕。酶化学法：取出装有检测卡的铝箔袋及样本稀释液等试剂放置室温30 min，使其恢复室温，插入窥阴器，长棉拭子从阴道侧壁或后穹窿处尽可能多采集分泌物，立即送检；取一样本管，将分泌物拭子置于该管中，滴加样本稀释液8～10滴；充分涮洗后用手指轻轻挤压试管壁，使拭子吸附的液体流回试管，弃拭子，得到样本液，立即检测或盖紧置冰箱短时间冷藏；从包装袋中取出检测卡，轻轻揭掉板贴，用吸管吸取样本液，在检测卡的每孔滴加1滴样本液，之后分别滴加显色液，置37℃温育10 min，观察各孔反应，与比色卡对比。酶联免疫吸附试验：从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，空白孔加标准品和标本稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100 μl/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90 min，洗板5次。空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100 μl/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60 min，洗板5次。空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100 μl/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30 min，洗板5次。加入显色底物(TMB)100 μl/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15 min，加入终止液100 μl/孔，混匀后即刻测量OD450值(3 min内)。

1.3观察指标 观察两组阴道菌群、血清T细胞亚群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)、炎性因子(IFN-γ，IL-2、IL-4)，比较观察组不同阴道菌群情况、HPV感染情况患者的T细胞亚群和炎性因子水平。

1.4统计学分析 采用SPSS24.0软件进行t检验、χ2检验、Logistic回归分析；绘制受试者工作特征(ROC)曲线评估T细胞亚群和炎性因子对阴道微生态失调的诊断价值。

2 结 果

2.1两组阴道菌群比较 两组衣原体阳性率差异无统计学意义(P>0.05)；观察组滴虫、霉菌、支原体、细菌性阴道炎阳性率、阴道微生态失调比例均明显高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组阴道菌群比较〔n(%)〕

2.2两组血清T细胞亚群和炎性因子水平比较 观察组CD4+、CD4+/CD8+、IFN-γ、IL-2水平均明显低于对照组，CD8+、IL-4水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 两组血清T细胞亚群和炎性因子水平比较

2.3血清T细胞亚群和炎性因子与慢性宫颈炎伴HPV感染相关性 Logistics回归分析显示，血清CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IFN-γ，IL-2、IL-4与慢性宫颈炎伴HPV感染相关(P<0.05)。见表4。

表4 血清T细胞亚群和炎性因子与慢性宫颈炎伴HPV感染的关系分析

2.4不同阴道微生态状态慢性宫颈炎伴HPV感染患者血清T细胞亚群和炎性因子水平比较 阴道微生态失调患者CD4+、CD4+/CD8+、IFN-γ、IL-2水平均明显低于阴道微生态正常患者，CD8+、IL-4水平均明显高于阴道微生态正常患者(均P<0.01)。见表5。

表5 不同阴道微生态状态慢性宫颈炎伴HPV感染患者血清T细胞亚群和炎性因子水平比较

2.5血清T细胞亚群和炎性因子对中老年慢性宫颈炎伴HPV感染患者阴道微生态失调的诊断价值 血清CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IFN-γ，IL-2、IL-4诊断中老年慢性宫颈炎伴HPV感染患者阴道微生态失调的AUC分别为0.782、0.713、0.681、0.650、0.720、0.751。见表6，图1。

表6 血清T细胞亚群和炎性因子诊断中老年慢性宫颈炎伴HPV感染患者阴道微生态失调的ROC曲线分析

图1 血清T细胞亚群和炎性因子诊断中老年慢性宫颈炎伴HPV感染患者阴道微生态失调的ROC曲线

2.6中老年慢性宫颈炎伴HPV感染患者感染型构成情况 81例中老年慢性宫颈炎伴HPV感染患者中，高危型HPV感染占比59.26%(48/81)，其中HPV16 16例(19.75%)、HPV31 5例(6.17%)、HPV33 7例(8.64%)、HPV52 10例(12.35%)、HPV58 10例(12.35%)；低危型HPV感染占比40.74%(33/81)，其中HPV6 4例(4.94%)、HPV11 17例(20.99%)、HPV43 11例(13.58%)。

2.7不同HPV分型中老年慢性宫颈炎伴HPV感染患者与血清T细胞亚群和炎性因子水平比较 高危HPV感染患者CD4+、CD4+/CD8+、IFN-γ、IL-2水平均明显低于低危HPV感染患者，CD8+、IL-4水平均明显高于低危HPV感染患者(P<0.01)。见表7。

表7 不同HPV分型中老年慢性宫颈炎伴HPV感染患者与血清T细胞亚群和炎性因子水平比较

3 讨 论

慢性宫颈炎是常见妇科疾病，若未及时诊治，随着病情发展可能演变为宫颈癌〔10〕。HPV是嗜人黏膜、皮肤复层鳞状上皮的一类DNA病毒，与多种疾病如食管癌、肛周癌、宫颈癌、外阴癌、阴茎癌等均具有紧密联系〔11〕。慢性宫颈炎合并HPV感染不仅会加重病情，也会增加临床治疗难度。阴道菌群分布和阴道免疫功能是阴道微生态的重要组成部分，能够有效维持阴道微生态正常，阴道微生态平衡与女性生殖系统健康有密切关系，其能够有效隔绝外界病原微生物的入侵〔12〕。阴道是独特的动态变化的微生态体系，其中存在各种微生物菌群，与宿主环境之间保持相互协调、相互制约的微生态动态平衡，平衡破坏时HPV感染风险增加，也会促使HPV发展成癌。探究慢性宫颈炎伴HPV感染患者阴道菌群改变，并分析其与患者机体其他因子之间的关系，能够为临床诊治该病提供一定理论依据。

本研究结果说明中老年慢性宫颈炎伴HPV感染患者阴道菌群失调。韩一栩等〔13〕研究显示，老年高危HPV感染患者阴道菌群失调，与本研究结果一致。HPV会促进阴道微生物繁殖，导致引导微生物菌群分布紊乱，导致阴道微生态失调。HPV感染导致的阴道微环境改变包括pH值和免疫功能，这种改变利于微生物繁殖，不仅会引起阴道菌群改变、结构紊乱，而且外界病原微生物繁殖加速，促进宫颈炎、阴道炎等生殖系统炎症，诱发其他疾病〔14〕。本研究结果提示慢性宫颈炎伴HPV感染会改变患者免疫功能，升高炎症水平。李燕华等〔15〕研究结果中，合并HPV感染的不孕症患者相较HPV阴性的不孕症患者更易存在免疫功能紊乱。HPV感染并不是全身，局限于起始感染部位，第一防线阴道黏膜表面细胞免疫十分重要，T淋巴细胞是阴道局部细胞免疫的主要效应细胞，分为CD4+、CD8+两个细胞亚群〔16〕。其中CD4+可辅助细胞免疫和体液免疫，能够呈递抗原，在机体免疫应答中处于核心地位，作为辅助性T淋巴细胞，主要作用是协助B淋巴细胞分化并产生抗体，能够客观反映机体免疫状态。CD8+是抑制性T细胞和细胞毒性T细胞，具有免疫抑制作用和细胞毒性功能，CD4+细胞和CD8+细胞相互影响，共同调控免疫反应并维持免疫平衡，当CD4+细胞数目减少、CD8+细胞数目增加、CD4+/CD8+比例降低时机体免疫功能下降，导致各种疾病发生〔17〕。IFN-γ是活化的Th细胞和NK细胞产生的炎性因子，能够促进Th1细胞发育和抑制Th2细胞活化增殖，参与免疫调节过程〔18〕。IL-2在免疫应答和免疫调节过程中均属于核心细胞因子，能够直接影响机体免疫功能和免疫状态，当其表达增多时巨噬细胞杀伤肿瘤的活性增强〔19〕。IL-4能够促使Th细胞向Th2细胞分化，抑制Th细胞向Th1细胞分化，以此发挥抑制淋巴细胞激活杀伤细胞的功能。本研究Logistics回归分析进一步说明血清T淋巴细胞和炎性因子在其中发挥的重要作用。

本研究结果表明阴道菌群对机体免疫功能、炎症水平均会产生影响。具体分析可知，滴虫侵入机体后能够激发免疫应答反应，且滴虫性阴道炎常伴有严重炎症反应。霉菌性阴道炎发病与否不仅取决于致病菌的毒力，也与机体免疫防御功能有关。细菌性阴道病可能会导致Th1/Th2细胞免疫功能失衡，向Th2偏移，进而细胞免疫受到抑制，降低免疫功能。支原体进入女性生殖道时，可引起生殖道局部炎症反应和炎性细胞浸润，被活化的T细胞会分泌多种炎性因子，引起免疫应答。且ROC分析结果显示CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IFN-γ、IL-2、IL-4在诊断中老年慢性宫颈炎伴HPV感染患者阴道微生态失调中具有良好诊断效能，深入证实免疫功能和炎性细胞水平可反映阴道菌群改变和微生态环境。郑淑敏等〔20〕研究中，高危型HPV感染的老年宫颈癌患者HPV水平与宫颈局部免疫功能指标关系密切，与本研究结果一致。分析其原因，高危HPV病毒的E5蛋白会抑制免疫细胞中丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)信号通路活化，进而抑制抗原呈递和细胞因子分泌等免疫反应，导致机体免疫功能抑制，且HPV能够抑制干扰素信号通路活化，进而影响免疫细胞正常产生干扰素和T淋巴细胞的活化，患者机体T淋巴细胞数量减少，也会加重机体炎症水平。虽然与其他研究相比，本研究并未选择宫颈组织的相关指标水平进行对比分析，而是选择外周血检测指标水平，更易被患者接受。但本研究仍具有一定不足，首先纳入的样本较少，其次仅分析高危型和低危型HPV与免疫功能的关系，未深入分析这二者与阴道菌群的关系，也未对慢性宫颈炎不同严重程度、病变类型患者阴道菌群、免疫功能进行对比，未来还需加大样本量，在本研究基础上给予深入分析疾病严重程度、病变类型、HPV感染型别对阴道菌群、免疫功能的影响。

综上，中老年慢性宫颈炎伴HPV感染患者阴道菌群出现改变、微生态失调，且免疫功能下降，炎症水平上升，血清T淋巴细胞和炎性因子水平不仅和慢性宫颈炎伴HPV感染的发病、HPV感染型别有密切关系，也可辅助临床诊断阴道微生态失调。