丹参酮提取物对奶牛乳腺炎常见致病菌抑菌试验

陶 蕾，王广宇，王明彦，陈彦亮，樊志强，郭 杰，梁 妍，高宝山

（1.兰州市职业技术学院，兰州 730070；2.三门峡广宇生物制药有限公司，河南 三门峡 472400；3.河南省中药材生产技术推广中心，郑州 450000；4.兰州大学，兰州 730070；5.天津市武清区农村社会事业发展服务中心，天津 301700）

丹参是中医的一味常用中药，在植物分型中属于唇形科鼠尾草属范围，生长地方较为广泛，而在我国，盛产丹参的省份主要有河南、山西、河北等地[1]。丹参作为一种活血化瘀类药物被广泛应用，近年来也得到了国外的认可[2]，成功进入《美国药典》[3]。而丹参酮是丹参中提取出来的活性成分，该类成分具有较强的抑制金黄色葡萄球菌功效，如耐药金黄色葡萄球菌[4]。在奶牛养殖业发展期间，奶牛发乳腺炎的问题是最为常见的问题，奶牛乳腺炎的发生原因较多，而最为常见的致病因素则为物理因素及各种细菌、微生物，这些因素会在一定程度上刺激到奶牛的乳腺，进而逐步发展成为炎症病变，尤其是细菌、病原微生物感染等，目前，国内外应用抗生素是奶牛乳腺炎治疗的最有效办法。但随着抗生素的大量应用，耐药性不断产生，严重影响了疗效，同时，抗生素的使用会导致牛奶中蓄积药物，还会对奶牛造成肠道菌群失调。而通过中药有效成分能够克服抗生素治疗中的弊端，通过筛选抑菌作用强、对环境稳定的中药有效成分来防治奶牛乳腺炎，是绿色防控奶牛乳腺炎的一个重要课题。通过体外抑菌试验筛查各种有效成分，从而确定有效成分，为进一步研制新兽药打下基础。

1 材料

1.1 供试药物

丹参酮提取物（隐丹参酮含量3%，丹参酮ⅡA 11%），三门峡广宇生物制药有限公司生产。

1.2 菌株

无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、乳房链球菌（Streptococcus uberis）、从乳腺炎患牛乳汁中分离鉴定的菌株。

枯 草 芽 孢 杆 菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）[ATCC 35666]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、变形杆菌（Proteusbacillus vulgaris）[CMCC（B）49027]、化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）[ATCC 19615]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CICC 10419]，其来源为中国工业微生物菌种保藏与管理中心、中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.3 培养基

①MH营养肉汤；②依据无菌检查法配制的无菌生理盐水；③营养琼脂培养基；④MH营养琼脂；⑤营养肉汤培养基；⑥麦康凯琼脂培养基，以上各种材料均购置于广东环凯微生物科技；LB Broth（Lennox，SIGMA）；北京索莱宝（Solarbio）科技提供的无菌脱纤维绵羊血。所用试剂均为分析纯。

1.4 仪器与设备

本次所用仪器设备包含：①DW-86L338型立式超低温保存箱；②HPsafe-1200LC型生物安全柜；③麦氏比浊管；④GHP-9160型隔水式培养箱；⑤LDZX-30KBS型立式压力蒸汽灭菌器⑥HZP-250型全温振荡培养箱；⑦MX-S型漩涡混合；⑧DHG-9240A型电热鼓风干燥箱。

2 方法

2.1 最小抑菌浓度MIC值的测定

最小抑菌浓度MIC值的测定[5-6]：测定方法为常量稀释法，由经验丰富的医师开展操作，操作期间按照标准操作规范对实验菌株进行测定，通过管碟法观察其体外抑菌活性[7-8]。稀释液为MH肉汤（Mueller-Hinton Broth）。

2.2 接种菌量的准备

取各菌（细菌）的肉汤培养物先进行稀释处理，稀释的标准为10倍，完成以上操作后进行MH肉汤稀释，直至达到含菌量为1×107cfu/mL范围为止，并将以上培养物放于标准环境以备检测。

2.3 试管二倍稀释法联合琼脂平板法

在开展这一项试验过程中为了确保更加准确的成功率和详细的试验数据，应用2组对照的方式进行，2组的稀释方法一样，选取22支规格大小为5 mL的无菌离心管平均分为2组，各组留存1#管，其他的离心管分别将2 mL的MH肉汤加入，链球菌的方式为添加2%的小牛血清的MH肉汤，在研究组1#管、2#管中分别加入丹参酮提取物配置的原液，添加的剂量为2 mL，之后记录1#管为抗菌药物原液，并确保1#管的质量浓度为500 mg·mL-1。将2#管中的营养肉汤中加入丹参酮提取物，轻轻摇晃使其均匀后吸取2 ml混合液推注到3#管，按照这种方式持续对药液进行稀释，一直到10#管抽吸2 mL，并将其他离心管丢弃，完成以上操作之后，进行对照药液组中的11#管则属于无药液管。1#管中的药物质量浓度为500 mg·mL-1、2#管中的药物质量浓度为250 mg·mL-1、3#管中的药物质量浓度为125 mg·mL-1、4#管中的药物质量浓度为62.5 mg·mL-1、5#管中的药物质量浓度为31.25 mg·mL-1、6#管中的药物质量浓度为15.625 mg·mL-1、7#管中的药物质量浓度为7.81 mg·mL-1、8#管中的药物质量浓度为2.91 mg·mL-1、9#管中的药物质量浓度为1.95 mg·mL-1、10#管中的药物质量浓度为0.98 mg·mL-1。

2.4 接种

研究组1#管至11#管中控制加入的稀释菌液为每次100 μL，而参考组的各离心管则不添加稀释的菌液。完成稀释操作之后将菌液放于37℃恒温的培养箱中进行孵育，孵育时间为21 h左右。并对比分析2组药物浓度相等的离心管，并作为初步判定结果，如果离心管内的溶液显示为浑浊状态表示存在细菌生长，如果离心管的溶液表现为清澈透明，则判定为离心管内溶液没有出现生长的细菌，转种将试验组与对照组各管内的中药与细菌的培养物，划线接种至血琼脂平板，放置在37℃恒温的培养箱中孵育22 h左右。

2.5 结果判定

由试验者详细地对血琼脂平板上是否出现细菌生长进行观察和记录，本次受试丹参酮提取物对该菌的最低抑菌浓度判定标准为：血琼脂平板上没有出现生长细菌的离心管，并将以上的各菌重复3次，最终的平均值为最终测定水平。

2.6 管碟法

本次抑菌活性的测定方法为体外抑菌法[9-10]。详细的测定方法主要分为以下3个步骤：（1）准备好培养基平板，依据商品操作说明书规范配置水解酪蛋白琼脂培养基，在121℃的高温下灭菌15 min，直至温度下降到55℃左右，将其倾注无菌平皿，从而保持琼脂厚度4 mm。应用5%的脱纤维绵羊血的MH琼脂平板孵育链球菌。水解酪蛋白琼脂平板使用前应置35℃孵育30 min，试验人员应对其表面进行详细检查，查看是否处于干燥状态，避免由于表面潮湿影响试验结果；

（2）确定最佳涂布浓度：具体的方法是通过用营养肉汤（细菌）进行稀释处理，稀释的范围标准为各活化菌液10-1～10-5的10倍递增方法，完成稀释处理以后将其放置在37℃的环境中培养22 h左右，之后检测人员详细观察菌苔生长状况，并由此测得最合适的菌类涂布浓度；

（3）牛津杯加注丹参酮提取物药液法：检测人员应用生理盐水稀释制备的菌液，稀释的标准为涂布浓度，然后进行MH琼脂平板涂抹和接种操作，平板加盖置放于超净工作台内，干燥3 min以上，最长时间为15 min，并依次完成酒精灯微灼、琼脂与受试丹参酮提取物药液原液混合等操作。应在此期间将2张灭菌滤纸覆盖于牛津杯上，将杯盖合上，水平放置平皿，在37℃恒温培养箱中孵育22 h左右，并对试验结果进行观察。如果抑菌环直径在10 mm以内则判定结果为没有抑菌效果，如果超过10 mm而低于15 mm则表示存在较弱的抑菌效果，超过15 mm并低于22 mm则判定为中等的抑菌效果，如果超过22mm则表示抑菌效果强。

3 结果与分析

丹参酮提取物的最小抑菌浓度（MIC）及抑菌强度结果观察，见表1。

表1 丹参酮提取物最低抑菌浓度及抑菌圈直径结果

通过以上结果可以看出，丹参酮提取物对不同细菌的抑菌效果存在差异，抑菌效果最强的为链球菌属&枯草芽孢杆菌，其次属于金黄色葡萄球菌，抑菌效果处于中等范围，抑菌效果相对较差的为肠杆菌。

牛津杯加注丹参酮提取物药液的体外抑菌法结果与试管二倍稀释法结果相一致，丹参酮提取物（500 mg·mL-1）对各种菌均有较好的抑菌效果，其中对链球菌属和枯草芽孢杆菌具有较强的抑菌效果，抑菌圈直径介于22.5～25 mm区间；对肠杆菌的抑菌强度最低，抑菌圈直径在20.0～22.0 mm之间。抑菌强度大小依次为：链球菌属&枯草芽孢杆菌＞金黄色葡萄球菌＞肠杆菌。

4 讨论

中药具有一定的抑菌效果，药物成分不同、药物搭配方式不同也会产生不同的效果[5]，与抗生素等西药相比，中医的毒性更低，且长时间使用一般也不会产生抗药性，优势较多。丹参酮提取物是中医常用的补血补气药物，在奶牛乳腺炎治疗中也同样能够发挥良好的活血化瘀、补血补气功效，进而使奶牛乳腺炎病情得以改善、奶牛的机体免疫力得以提升。本次体外抑菌试验研究中，丹参酮提取物具备很强的抑制链球菌属和枯草芽孢杆菌功效，其检测所得的最低抑菌质量浓度值均在125 mg·mL-1以内，同时还具备一定抑制一般致病性肠杆菌和金黄色葡萄球菌的功效，抑菌效果最强的为链球菌属&枯草芽孢杆菌，其次属于金黄色葡萄球菌，抑菌效果处于中等范围，抑菌效果相对较差的为肠杆菌。

本次试验中，丹参酮提取物的抗菌活性与抗生素有一定差距，丹参酮提取物抑菌抗菌作用弱于抗生素的原因可能与本次测试期间的培养基状态及所选取的细菌含量和状态等因素有着密切的联系，造成本次试验结果中的抑菌作用效果不明显。

综上所述，丹参酮提取物作为一种纯中药制剂，优势众多，药物生产流程较为简单，可降低药物成本，并减少了使用期间的不良反应，对于多种细菌均可产生良好的抑制效果，具有很大的开发价值。该药物还可以与抗生素搭配使用，从而使药物之间互相协同，提高药物治疗效果，宜积极推广。