酸性硅胶净化-气相色谱-三重四极杆质谱法测定玉米中持久性有机污染物

张 炜， 杨永坛， 王松雪， 李 森， 蔡 娣， 李 丽

(国家粮食和物资储备局科学研究院，北京 100037)

玉米是我国的三大主粮之一，每年产量超过2亿吨[1]。玉米中存在真菌毒素，重金属等有害物质，这些物质不仅会直接危害到人体健康，同时也会通过饲料在各种畜禽体内积累，并通过食物链进入人体，造成危害。有机氯农药、多氯联苯和多溴联苯醚属于持久性有机污染物，是另一类有害物质，具有“致畸，致癌，致突变”三致作用，并可能导致人和动物等生物体内分泌失调，免疫障碍，并具有神经毒性，细胞毒性[2]。玉米在生长过程中，可以通过吸附和沉降等方式摄入等这三类物质[3,4]，并可能在玉米籽粒中蓄积，成为危害人们健康的安全隐患。目前，对玉米中有机氯农药[5-8]、多氯联苯[4,9,10]的研究较多，而对其中多溴联苯醚[4]的研究较少。

对玉米中持久性有机污染物的分析，主要采用气相色谱-电子捕获检测器[5,8,11-13]、气相色谱-质谱[6,14,15]等方法进行检测。但是，由于玉米中含有的有机杂质多样而且含量较高，一般需要对样品进行较为复杂的提取和净化。样品提取主要采用加速溶剂萃取[8,11]、索氏提取[10,14]、微波辅助提取[16]等方法进行样品提取。这些提取方法一般耗时较长，操作比较复杂，不易进行大量样品的分析。而对提取物的净化一般采用磺化法[14,17]、凝胶色谱法[11,18]。磺化法是使用浓硫酸进行洗涤，可以有效去除共提取的脂类物质，但是其操作较为复杂，并存在一定的危险。凝胶色谱法的净化效果好，但是需要贵重的仪器，并且耗时较长，消耗溶剂量大，样品通量小。固相萃取法是通过采用填料对提取物中的杂质和目标物吸附能力不同而进行净化，其操作简单，选择灵活，是理想的净化方法。

本研究采用直接提取法对玉米样品中多氯联苯、有机氯农药、多溴联苯醚27种典型持久性有机物污染物进行提取，简化操作，使用酸性硅胶对提取物进行净化，并采用气相色谱-三重四极杆质谱对其进行检测分析，从而建立玉米中典型持久性有机污染物的高灵敏分析方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与标准品

正己烷、乙酸乙酯、异辛烷、二氯甲烷(农残级)；乙腈、丙酮(HPLC级)；氯化钠，无水硫酸镁(分析纯)。硅胶填料(60～200 mesh)，44%硫酸酸化硅胶，碱性氧化铝，石墨化碳黑，N-丙基乙二胺(PSA)，C18填料，中性氧化铝，酸性氧化铝，氨基填料，弗罗里硅土。

标准品：7种有机氯农药单体单标：α-六六六(α-HCH)，β-六六六(β-HCH)，γ-六六六(γ-HCH)，δ-六六六(δ-HCH)，ε-六六六(ε-HCH)，2,4’-滴滴涕(2,4’-DDT)，4,4’-滴滴涕(4,4’-DDT)(质量浓度为100 μg/mL)；7种多氯联苯混标和每种单体单标：2,4,4′-三氯联苯(PCB28)，2,2′,5,5′-四氯联苯(PCB52)，2,2′,4,5,5′-五氯联苯(PCB101)，2,3′,4,4′,5-五氯联苯(PCB118)，2,2′,3,4,4′,5′-六氯联苯(PCB138)，2,2′,4,4′,5,5′-六氯联苯(PCB153)，2,2′,3,4,4′,5,5′-七氯联苯(PCB180) (质量浓度均为100 μg/L)；13种多溴联苯醚混标和每种单体单标：4-溴联苯醚(BDE3)，4,4′-二溴联苯醚(BDE15)，2,3’,4-三溴联苯醚(BDE25)，2,4,4′-三溴联苯醚(BDE28)，2,2′,4,4′-四溴联苯醚(BDE47)，2,2′,4,4′,5-五溴联苯醚(BDE99)，2,2′,4,4′,6-五溴联苯醚(BDE100)，2,2′,4,4′,5,5′-六溴联苯醚(BDE153)，2,2′,4,4′,5,6′-六溴联苯醚 (BDE154)，2,2′,3,4,4′,5′,6-七溴联苯醚(BDE183)，2,2′,3,4,4′,5,5′,6-八溴联苯醚(BDE203)，2,2′,3,3′,4,4′,5,5′,6-九溴联苯醚(BDE206)，十溴联苯醚(BDE209) (质量浓度均为50 μg/mL)；氘代2,3,3′,4,4′,5-六氯联苯-d3(PCB156-d3)(质量浓度为10 μg/mL)；氘代2,4,4′-三氯联苯-d4(PCB28-d4) (质量浓度为10 μg/mL)。

1.2 样品

玉米样品采集自我国东北玉米产区，样品经脱粒除杂后，玉米籽粒进行粉碎，常温下密封保存。

1.3 仪器与设备

8890B气相色谱-7000D三重四极杆质谱仪，配有MMI多功能进样口及7693A自动进样器，5810R低温高速离心机，N-EVAP112氮吹仪，Rotavapor R-300旋转蒸发仪，ML3002T天平(精度0.01 g)，Fotector Plus自动固相萃取仪。

1.4 实验方法

1.4.1 标准溶液配制

以异辛烷配制27种持久性有机物的混合标准储备液(7种有机氯农药，7种多氯联苯，9种多溴联苯醚(BDE3、15、25、28、47、99、100、153、154)的质量浓度为2 g/mL，BDE183质量浓度为4 g/mL，BDE203质量浓度为6 g/mL，BDE206质量浓度为8 g/mL，BDE209质量浓度为10 g/mL)，定量内标(PCB156-d3)(质量浓度为100 g/L)工作液，进样内标(PCB28-d4)的工作液(质量浓度为100 g/L)。

将27种持久性有机物的混合标准储备液用异辛烷进行逐级稀释，并加入定量内标工作液，配制为质量浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 g/L(其中BDE183为2倍，BDE203为3倍，BDE206为4倍，BDE209为5倍)的标准曲线工作液，其中定量内标质量浓度为10.0 g/L。所有溶液均置于-18 ℃避光保存。

1.4.2 样品前处理提取

准确称取10.0 g玉米粉于50 mL离心管之中，加入100 L定量内标，混合均匀。加入10 mL水，充分振荡使均匀；加入15 mL乙酸乙酯，充分振摇3 min；向混合物中依次加入3 g氯化钠和3 g无水硫酸镁，充分摇匀后，以10 000 r/min高速离心5 min(10 ℃ )使固液分离，将上层有机层尽量移取备用。向剩余物中再次加入15 mL乙酸乙酯，充分振摇1 min后，高速离心5 min(10 ℃ ，10 000 r/min)，取上层有机层。合并有机提取液后待净化。

室温下，在旋转蒸发仪上将提取液中的乙酸乙酯蒸发至近干，向剩余油状物中加入1 mL正己烷复溶，过固相柱净化。固相柱由5 g酸性硅胶(44%)装填并先用10 mL正己烷/二氯甲烷混合液(3/1)和10 mL正己烷淋洗。将样品加载于固相柱上，依次用6 mL正己烷和20 mL正己烷/二氯甲烷混合液(3/1)淋洗，收集加载样品后的所有淋洗液。在旋转蒸发仪上将收集液中溶剂蒸发至剩余约0.5 mL，转移至进样小瓶中，用约1 mL二氯甲烷洗涤所用容器后，转移至进样小瓶中。采用氮气将溶剂吹干后，加入900 L异辛烷和100 L进样内标并混匀，待GC-MS/MS分析。

1.4.3 气相色谱-三重四极杆质谱(GC-MS/MS)分析条件

色谱条件：色谱柱为DB-5MS 毛细管色谱柱(15 m×0.25 mm×0.1 m)；进样采用程序升温(PTV)加压不分流进样模式：进样口初始温度为150 ℃，保持0.1 min后以600 ℃/min的升温速率升温至310 ℃，并保持至分析结束，进样口压力为25 psi，保持1.2 min；进样量为2 L。载气为氦气，流速为1.2 mL/min；柱温箱初始温度为90 ℃，保持0.5 min，以5 ℃/min升至190 ℃，再以20 ℃/min升至320 ℃，保持5 min。传输线温度为290 ℃。

质谱条件：离子源为电子轰击源(EI)，离子源温度为300 ℃；Q1，Q3四极杆温度均为200 ℃；碰撞气为氮气，流速设为1.5 mL/min；淬灭气为氦气，流速设为2.25 mL/min；质谱采用动态多反应检测模式(dMRM)；每个目标分析物分别选择一对定量离子、一对定性离子。每个目标分析物的保留时间，定量离子对、定性离子对和碰撞电压见表1。电子倍增器(CEM)增益因子为15。

表1 27种目标持久性有机污染物，定量内标和 进样内标的气相色谱-三重四极杆质谱参数

1.5 数据处理方法

采集到的数据使用MassHunter WorkStation进行定性定量分析；样品分析时，每个化合物以保留时间，2对离子对及相对比例进行定性；以定量离子对，根据标准曲线进行定量。

2 结果与讨论

2.1 气相色谱-三重四极杆质谱分析条件

采用气相色谱-三重四极杆质谱对多氯联苯、有机氯农药和多溴联苯醚进行同时分析。本研究以多溴联苯醚为主要关注对象，结合文献[19,20]，为减少高取代多溴联苯醚在气相进样口和色谱柱上的分解，采用较短的DB-5色谱柱进行气相色谱分离；并采用程序升温方式(PTV)进样[20]，避免了进样口对不同沸点物质的“歧视”。质谱检测器采用多反应监测(MRM)模式，通过对每个化合物进行全扫描，子离子扫描以及碰撞能优化，对每个化合物确定了两对特征离子对，分别作为定量离子对和定性离子对(表1)。在优化的分析条件下，27种持久性有机污染物的气相色谱-三重四极杆质谱总离子流色谱图见图1。

2.2 样品前处理条件优化

样品前处理技术是玉米中持久性有机污染物测定的关键。对玉米中的有机污染物的提取过程中，玉米中的有机杂质也会被共提取，尤其是脂质物质和色素，这些物质会对后续分析产生严重的影响[21,22]，导致目标物的保留时间偏移，分离度变差，以及多溴联苯醚的分解。因此，需对提取物进行净化，去除共提取杂质。对样品提取和净化的条件进行优化。

2.2.1 提取溶剂比较

多氯联苯、有机氯农药和多溴联苯醚均为弱极性化合物，当对固体基质样品中这些物质进行提取时，一般采用极性较小的有机溶剂，如乙酸乙酯、正己烷、丙酮、二氯甲烷等。乙腈是常用于QuEChERS法的提取剂，也可以用于持久性有机污染物的提取。采用直接提取法，比较了乙酸乙酯、乙腈、正己烷/丙酮(1/1)和正己烷/二氯甲烷(1/1)对玉米中持久性有机物污染物的提取效果。在10 g/L水平，将标准品的色谱峰面积与添加样品前处理后各目标分析物的色谱峰面积进行比较。根据结果(图2)，乙酸乙酯的提取效果最好；正己烷/丙酮(1/1)的提取效果也较好，但相比于乙酸乙酯，其经济性略差，而且操作略复杂；正己烷/二氯甲烷(1/1)的提取效率相对较差；而采用乙腈进行提取，尽管有助于去除部分脂质物质，但是其提取效率过低，不能充分提取目标分析物。考虑到玉米中持久性有机污染物含量一般较低，为了提高提取效率，选取乙酸乙酯作为提取溶剂，2次提取。

2.2.2 净化条件优化

玉米中的脂肪和色素的含量较高，在提取过程中，这些弱极性的有机物被一同提取出来，需要进行净化。本研究采用固相净化柱法对提取物进行净化，比较了硅胶、44%酸性硅胶、氧化铝、氨基填料、PSA、C18、弗罗里硅土等不同净化填料的净化效果。根据结果，硅胶、氧化铝、弗罗里硅土、氨基填料等仅能去除部分杂质，尤其不能有效去除脂类物质。而C18、PSA基本无法去除玉米样品中的共提取干扰物质。而采用44%的酸性硅胶填料可以有效去除提取物中的脂质物质和色素等杂质。酸性硅胶结合了磺化法和硅胶柱层析法2种方法的特点，属于破坏性净化方式，通过浓硫酸氧化和水解达到去除油脂等杂质的目的，同时避免使用硫酸洗涤样品时的繁琐操作和潜在危险；硅胶载体上未被功能团化的位点可以与样品中的各种极性化合物结合，从而与弱极性的持久性有机污染物进行分离，实现净化目的。而硅胶、氧化铝等净化剂主要是通过吸附作用与脂类等杂质结合，由于其结合力较弱，在洗脱剂的作用下，容易造成共流出，不能完全净化。

图1 27种持久性有机污染物气相色谱-三重四极杆质谱总离子流色谱图(TIC)

图2 不同提取溶剂的提取效率比较

图3 不同酸性硅胶用量的净化效果比较

2.2.3 酸性硅胶用量

酸性硅胶的用量也对净化效果有较大的影响[21]。玉米样品经提取后，其粗脂肪质量分数一般在4%左右，为了更有效稳定地去除杂质，比较了使用2、3、4、5 g的酸性硅胶进行提取物净化的效果。结果显示，经不同用量的酸性硅胶净化后，虽然目标分析物的回收率的差别不大(图3)，但在实际实验过程中，使用2 g和3 g用量的硅胶时，洗脱过程中容易发生穿滤，不能有效去除杂质，从而对后续分析产生影响。而使用4 g和5 g用量的酸性硅胶净化时，可以稳定的去除杂质。综合考虑方法的适用性，本研究选取5 g酸性硅胶用量用于提取物的净化。

2.3 方法的检测限、回收率、重复性及线性范围

2.3.1 标准曲线绘制

对持久性有机污染物的分析，通常采用内标法进行定量。采用内标法，可以补偿待测组分在样品前处理时的损失，而且可以去除基质效应。氘代多氯联苯PCB156-d3与目标分析物具有相似性质，而且在环境和玉米中不存在。本研究选用该物质为定量内标，通过多点标准曲线法，确定27种目标分析物的定量范围。多氯联苯，有机氯农药和4种低取代溴联苯醚(BDE3, 15, 25, 47)在0.1～20 g/L的质量浓度范围内呈较好的线性关系；而多溴联苯醚BDE99，BDE100和BDE153，BDE154则分别在0.2～50 g/L和0.5～100 g/L范围内呈较好的线性关系；而七溴代(BDE183)、八溴代(BDE203)，九溴代(BDE206)和十溴代(BDE209)联苯醚受其稳定性的影响，其响应与质量浓度的关系为二次曲线关系，线性范围分别为0.6～200 g/L，4～300 g/L，6 400 g/L，25～500 g/L；所有化合物的回归决定系数(R2)均大于0.996(表2)。

表2 27种持久性有机污染物的线性回归方程和决定系数

续表2

2.3.2 加标回收率，方法检出限和定量限

向空白玉米样品中添加不同质量浓度的27种持久性有机污染物的混合标准溶液，配制为0.4、1.0、2.0 ng/g(其中BDE183、203、206、209的质量浓度分别为2、3、4、5倍)添加水平的样品。样品采用1.4.2进行前处理，并按照1.4.3进行GC-MS/MS测定，每个水平样品测定6次。计算每个目标物的平均回收率和相对标准偏差(RSD)，定量内标以进样内标为参照，通过内标法计算定量内标的回收率并计算RSD。表3表明，玉米基质中多氯联苯，有机氯农药和多溴联苯醚单体回收率在55.7%～119.6%之间，相对标准偏差(RSD)为1.4%～16.2%之间；定量内标PCB156-d3的回收率为62.7%～84.9% (RSD 5.4%～12.1%)。仅有4-溴联苯醚(BDE3)因具有较高的挥发性，回收率低而且不稳定[23]，因此不能进行定量，这可能是样品前处理过程中4-溴联苯醚损失较多所致。

采用每个化合物方法检出限2～10倍的标准添加样品，按公式计算方法检出限(LOD)。方法定量限(LOQ)以3.3倍方法检出限进行计算。

LOD=SD×t(在自由度为6，置信水平为99%时的t值为3.14)

玉米基质中，7个多氯联苯、7个有机氯农药和3个多溴联苯醚(BDE15、25、47)共17个化合物的检测灵敏度较高，检出限在0.003～0.010 ng/g之间；5个多溴联苯醚(BDE99、100、153、154、183)的检出限稍差，为0.016～0.049 ng/g之间；高取代多溴联苯醚(BDE203、206、209)的检出限较差，为0.240、0.553、1.174 ng/g(见表3)。

表3 玉米中27种持久性有机污染物的加标回收率及精密度

2.4 实际样品测定

采用建立的玉米中多氯联苯、有机氯农药、多溴联苯醚的检测方法对我国某玉米产区的12份玉米样品进行检测。在9个样品中检出PCB28，其中1个样品中的PCB28含量为14 pg/g；4个样品中检出PCB52；4个样品中检出α-六六六单体或4,4′-滴滴涕单体；1个样品中检出十溴联苯醚BDE209。所检测玉米样品中，持久性有机污染物的含量很低，多数检测阳性结果的样品中的含量小于相应目标物的定量限。其中，六六六、滴滴涕和多氯联苯的含量均远小于食品安全国家标准GB2763和GB5009.190的限量要求，说明所采集的玉米样品安全，同时也反映出玉米生长地的环境中持久性有机污染物的残留很低。

3 结论

建立了玉米中多氯联苯、有机氯农药和多溴联苯醚三类持久性有机污染物的前处理方法和气相色谱-三重四极杆质谱分析方法。采用乙酸乙酯对玉米样品进行直接提取，并采用酸性硅胶净化，可以有效提取净化持久性有机污染物。所建立的方法样品前处理操作较为简单，溶剂使用量少，除4-溴联苯醚(BDE3)因挥发性造成损失较高外，其余目标持久性有机污染物的回收率高，具有较好的准确度和精密度，检出灵敏度高，适用于玉米样品中的痕量持久性有机污染物的快速鉴别和分析。