储藏时间对大豆蛋白和谷朊粉的结构及功能特性的影响

安红周， 丁 皓， 黄泽华， 李盘欣

(河南工业大学粮油食品学院1，郑州 450001) (河南省谷物品质分析与加工国际联合实验室2，郑州 450001) (河南省南街村(集团)有限公司3，许昌 462600 )

大豆分离蛋白(SPI)、大豆浓缩蛋白(SPC)和谷朊粉(WG)作为组织化植物蛋白生产所使用的3种主要原料，应用广泛。这些蛋白原料从生产到加工成组织化蛋白会有一定的储藏运输期，其结构在储藏过程中可能会由于蛋白氧化而发生一定程度的改变，进而导致其功能特性的变化。有研究表明蛋白质的溶解度、持水性、持油性和巯基含量会显著影响组织化蛋白的质构特性。

储藏时间对蛋白质功能特性和分子结构的影响是学者们关注的重点。Boartright等[1,2]研究了SPI在储藏过程中的蛋白质氧化，发现在储藏过程中蛋白质的氧化是普遍存在的。刘宝华等[3]研究发现随着储藏时间的延长，蛋白氧化导致SPI的表面疏水性降低；刘紫薇等[4]发现经过高温湿热处理的SPI变性程度加剧，使更多的疏水基团暴露，导致表面疏水性的提高。Guo等[5]发现不同pH的SPI粉末在37 ℃储藏过程中羰基含量均显著增加，溶解度均下降，而巯基含量先降低后变化不显著；Xu等[6]有同样的研究结果，且发现不同储藏期的SPI生产的千页豆腐品质有显著性差异。Sun等[7]发现随着储藏时间的延长，花生分离蛋白发生变性和聚集，导致游离巯基含量、表面疏水性降低以及二级结构的变化，从而影响其功能特性。由此可见，储藏期内植物蛋白理化指标(游离巯基含量等)及蛋白结构的变化，对其加工及产品品质具有重要影响。而本研究的3种植物蛋白能够提供独特的结构、组织化和营养特性，是组织蛋白生产的重要原料之一，现有文献鲜有对其表面疏水性、持水性和持油性等特性在储藏期内的变化有系统研究。因此研究其在储藏期内的性质变化对蛋白原料的储藏、组织蛋白的生产以及其加工品质的提升具有重要意义。

本实验为了缩短储藏研究周期，利用提高温度增加反应速率的方法研究原料的性质变化，对3种原料进行加速储藏实验[8-10]。根据阿伦尼乌斯公式，对于常规化学反应，在一定温度范围内，反应温度每升高10 ℃反应速度常数提高1倍。一般蛋白粉在常温干燥的仓库中储藏期为12个月，本实验采用40 ℃(非蛋白开始变性温度[11-13])加速3个月模拟20 ℃条件下存放12个月。同时采用Ellman试剂法、溴酚蓝法、凯氏定氮法分别测定蛋白质的二硫键含量、表面疏水性和氮溶指数，研究储藏期间3种主要组织蛋白原料的结构及功能特性的变化规律。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、谷朊粉、2,4-二硝基苯肼、盐酸胍、DTNB、Tris、三氯乙酸、甘氨酸、EDTA、溴酚蓝、考马斯亮蓝G250、β-巯基乙醇，试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LXJ-ⅡB低速离心机，CenLee20K台式高速离心机，UV762紫外可见分光光度计，Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪。

1.3 方法

1.3.1 原料的储藏

购买最新日期(正式加速储藏实验开始前2周内)的大豆分离蛋白(SPI)、大豆浓缩蛋白(SPC)和谷朊粉(WG)。将SPI、SPC和WG采用工厂包装袋包装(纸塑复合袋)，置于40 ℃，RH=50%恒温恒湿箱中储藏。储藏时间为90 d，每隔15 d取样分析。

1.3.2 基础指标

水分：根据GB 5009.3—2016直接干燥法测定；灰分：根据GB 5009.4—2016测定；粗脂肪：根据GB 5009.6—2016测定；粗蛋白：根据GB 5009.5—2016测定；还原糖：GB 5009.7—2016测定。

1.3.3 分子结构测定

1.3.3.1 羰基含量测定

参考Levine等[14,15]的方法并略加改动：配制一定浓度的溶液，离心后用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白质含量。吸取0.35 ml蛋白溶液与1.5 mL含有10 mmol/L的DNPH的2 mol/L的HCl混合，空白样为蛋白溶液与2 mol/L HCl混合，30 ℃水浴保温1 h。加入2 mL 20%三氯乙酸后静置20 min，10 000 g离心10 min 后弃去上清液。用1 mL乙醇-乙酸乙酯混合溶液(1∶1)洗涤沉淀，10 000 g离心10 min弃去上清液，重复洗涤3次。最后用3 mL 0.1 mol/L含6 mol/L盐酸胍的磷酸盐缓冲液(pH=7)溶解沉淀，37 ℃水浴30 min，每间隔10 min剧烈振摇1次。以空白为对照在370 nm处作校正，以22 000mol/ (L·cm)为消光系数计算每mg蛋白质羰基衍生物的摩尔数。

1.3.3.2 游离巯基和二硫键的测定

利用紫外可见分光光度计，参考薛腊梅[16]的方法进行测定。

1.3.3.3 表面疏水性测定

参考代晓凝等[17]的方法并稍作修改，采用溴酚蓝法，取10 mg 蛋白样品溶于1 mL 20 mmol/L磷酸盐缓冲液中(pH 7.0)，加入200 μL 1 mg/mL的溴酚蓝指示剂混匀10 min后离心(WG：4 000 g，10 min；SPI和SPC：10 000 g，10 min)。将上清液稀释10倍，空白对照中无蛋白样品，在595 nm下测其吸光度。结果计算见式(1)。

溴酚蓝结合量(μg)=200×(A空-A样)/A空

(1)

式中：A空为空白的吸光度；A样为样品的吸光度。

1.3.4 功能特性测定

氮溶指数测定：根据AACC 46-23测定。

持水性：准确称取3.00 g储藏的蛋白样品于50 mL离心管中,加入20 mL去离子水，充分混匀，室温下静置30 min，4 000 r/min离心20 min，弃掉上清液，将离心管倒置于滤纸上进一步除去上清液，10 min后称量质量。持水性大小以每克样品吸附水的质量表示。

持油性：准确称取1.00 g储藏后的WG和3.00 g储藏后的SPI和SPC样品与20 mL大豆油充分混匀，3 500 r/min离心20 min，步骤与持水性测定相同。

吸水率：根据GB/T 21924—2008中谷朊粉吸水率测定方法。

1. 4 数据统计方法

每组实验进行3次平行实验，利用 SPSS Statistics 25 软件对数据进行 ANOVA 差异显著性分析，P<0.05为显著性差异，采用 Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 原料基本指标

表1为从厂家购进最新日期的原料的基础指标测定，除水分外，其他均为干基。

表1 原料成分表

2.2 储存时间对原料羰基含量的影响

蛋白质羰基形成是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，蛋白质羰基含量可直接反映蛋白质的氧化程度[5]。

由图1可知，随着储存时间的延长，3种蛋白的羰基含量整体是上升的，说明蛋白氧化一直在发生。谷朊粉羰基含量起伏可能因为谷朊粉可溶性蛋白粒径较小，高速离心后沉淀下来的谷朊粉很难离散开，导致洗涤不完全，影响实验结果。蛋白在储存中不可避免地接触到氧气，活性氧的攻击会导致蛋白质多肽主链骨架断裂和氨基酸侧链氧化，也会对蛋白中微量的脂质进攻从而引起脂质过氧化[18]，产生活性羰基物质；同时在储藏过程中，氨基酸和还原糖之间发生的美拉德反应也会在蛋白质侧链中引入活性羰基。实验结果表明蛋白质氧化程度逐渐增加，将会导致肽链的断裂，氨基酸侧链残基的氧化以及蛋白质高级结构的改变[19]。

图1 储藏过程中蛋白质羰基含量变化

2.3 储存时间对原料巯基和二硫键含量的影响

由图2、图3可知，蛋白巯基含量整体呈下降趋势，SPI和SPC的巯基含量在加速储存15 d(模拟常温储藏2个月)后急剧下降，说明在前15 d(前2个月)时其巯基氧化速率较快，随着储存时间的延长，巯基含量缓慢下降；WG在储存过程中整体呈现缓慢下降的趋势。巯基含量的下降伴随着二硫键含量的上升，说明巯基被氧化形成二硫键。3种蛋白的二硫键含量整体趋势先增大后减小，SPI和WG在加速储藏45 d(6个月)时，二硫键含量达到最大，SPC加速储存到30 d(4个月)，二硫键含量达到最大。随着储藏时间的延长，二硫键含量下降，这主要是由于蛋白质氧化使巯基被氧化成为不可逆氧化状态，形成了非二硫键的含硫化合物，如亚磺酸和磺酸[6]。郭凤仙[20]发现在储藏后期，游离巯基含量上升，推测是由于蛋白氧化导致蛋白结构发生轻微展开，内部巯基暴露出来导致。本实验过程中蛋白巯基含量同样有回升现象，表明氧化使蛋白结构伸展。二硫键含量在储藏后期降低可能是由于实验采用的加速储存温度是40 ℃，加快了蛋白氧化的速率，使巯基被氧化的程度加剧，变成不可逆状态，故本实验相对完整地研究了蛋白在整个储藏期(12个月)内二硫键含量变化趋势。SPI的游离巯基含量与低水分组织化蛋白弹性呈显著正相关[21]，使用最新生产的SPI生产低水分组织蛋白能获得较好的弹性。

图2 储藏过程中蛋白质游离巯基含量变化

图3 储藏过程中蛋白质二硫键含量变化

2.4 储存时间对原料表面疏水性的影响

表面疏水性可以用于表征蛋白质的空间构象，衡量蛋白分子表面疏水性基团的相对含量，评价蛋白质的变性程度[22]。溴酚蓝与蛋白质上的疏水位点结合，结合的溴酚蓝含量越高，即表面疏水性越强[23]。由图4可知，加速储藏15 d(2个月)后，溴酚蓝含量显著升高，表面疏水性显著性增加。随着加速储藏时间的延长，表面疏水性有一定程度的下降。在储藏前期可能是由于蛋白质轻微氧化使蛋白质分子结构伸展，蛋白质内部的疏水性基团暴露，导致表面疏水性增强[24,25]。在储藏后期，氧化程度增加，暴露的疏水基团由于疏水相互作用聚集起来，生成氧化聚集体，使蛋白质疏水性基团逐渐包埋于分子内部，表面疏水性降低[26]。如黄友如[27]在LOX-亚油酸-大豆蛋白模拟体系中发现随着大豆蛋白氧化程度的增加，其表面疏水性逐渐下降。

图4 储藏过程中蛋白质表面疏水性变化

2.5 储存时间对原料溶解度的影响

蛋白质的溶解度显著影响着蛋白质的功能特性，通常用NSI(氮溶指数)来表示蛋白质的溶解度。如图5所示，SPI的溶解度在加速储存前60 d(8个月)匀速下降，之后下降变得平缓。SPC的溶解度在加速储存前30 d(4个月)中下降幅度大，比SPI的下降速率更快，在之后的储藏中下降速率同样变得平缓。李祖胤[18]通过添加自由基淬灭剂、单线态氧淬灭剂和还原剂研究发现SPI 溶解度下降可能由二硫键的生成并形成不可溶性聚集所导致。本实验中在加速储藏前期SPI和SPC的二硫键均逐渐增加，且SPC的二硫键含量增加速率比SPI的快，这与SPC的溶解度下降趋势快有一定相关性。当二硫键含量下降时，SPI和SPC的溶解度仍然降低，这可能是由于随着氧化程度的增加，不可溶性聚集体增多，导致溶解度下降[28]。此外，美拉德反应也会影响大豆分离蛋白的溶解性，在长时间反应下，美拉德反应进入高级阶段，生成不溶于水的大分子聚合物[29]，使得溶解度降低。

对于WG来说，在整个加速储藏期内溶解度显著增加。宋永令等[30]测定不同温度下谷朊粉的溶解度时，发现温度在30～60 ℃时，随着温度的升高，蛋白质分子结构展开，提高蛋白质分子的分散能力，溶解度逐渐增大。WG的溶解度增加可能是随着氧化的进行使谷朊粉中的谷蛋白大聚体解聚，蛋白分子结构变得疏松，在水中更易分散，NSI 得以提高[31]。NSI越高，蛋白的组织化能力越好[32]，SPI溶解度降低将会使低水分组织化蛋白感官评价评分降低[21]，SPC的溶解度降低会增加低水分组织蛋白的复水率，降低咀嚼度，同时会减小高水分组织化蛋白的感官评价[33]。

图5 储藏过程中蛋白质溶解度变化

2.6 储存时间对原料持水性、持油性的影响

蛋白质溶解度的变化又进一步影响蛋白质的持水性和持油性等功能特性。如图6所示，在储存过程中，3种蛋白的持水性整体上呈现出下降的趋势，SPC的持水性在加速储藏前30 d(4个月)下降速率较快，与溶解度变化趋势相似。在储藏过程中蛋白中微量油脂的氧化也可能导致持水性的降低。如邓克权[34]认为大豆蛋白被脂质过氧化产物氧化减小了蛋白质和水结合的能力，导致大豆蛋白的持水性下降。吴伟等[35]利用过氧自由基代替脂质自由基氧化大米蛋白导致其结构改变，更多疏水基团暴露，降低大米蛋白的持水能力。

由图7可知，SPI和WG的持油性先升高后降低，SPC的持油性在加速储藏75 d(10个月)后出现显著性下降，持油性变化趋势与本实验测定的表面疏水性变化趋势相似，可能与蛋白质氧化后亲水/疏水性基团分布有关[36]。刘晶等[37]利用丙二醛氧化大豆蛋白，随着丙二醛浓度的增加，大豆蛋白部分去折叠，疏水性基团外露，持油性呈现先上升后下降趋势。蔡勇建[38]发现短期储藏时米糠蛋白氧化程度较低，暴露的疏水基团与脂质相结合而使米糠蛋白的持油性増加；随着储藏时间延长，氧化程度加深，大量暴露的疏水基团形成氧化聚集体，减小米糠蛋白对脂质的截留能力，导致持油性显著下降。

谷朊粉的吸水率是指蛋白质形成面筋的吸水能力，用来衡量其活性[39]。在整个加速储藏过程中，WG的吸水率在160%左右，没有显著性变化，说明WG活性变化不显著，变性程度较小。

SPI的持油性与低水分组织蛋白的咀嚼性呈显著正相关[21]，使用加速储存45 d(6个月)后的SPI生产的低水分组织蛋白的咀嚼性可能会显著性降低。薛晓程等[40]研究发现谷朊粉的持水性与低水分组织蛋白的黏聚性呈显著正相关，随着储藏的进行，谷朊粉的持水性下降，可能会使组织化蛋白的黏聚性降低。

图6 储藏过程中蛋白质持水性变化

图7 储藏过程中蛋白质持油性变化

2.7 储藏过程中各指标间的相关性分析

蛋白质在储存过程中被氧化，会引起蛋白结构的改变，进而引起功能特性的变化。利用Pearson相关性分析探讨蛋白结构和功能特性之间相关性。

如表2～表4所示，各蛋白在储存过程中蛋白质结构和功能特性之间具有一定的相关性。对SPI而言，羰基含量与巯基含量之间存在显著负相关，与NSI之间存在极显著负相关，表面疏水性与巯基含量之间存在极显著负相关，与持油性之间存在极显著正相关。对SPC而言，羰基含量与NSI呈极显著负相关，与持水性呈显著负相关，巯基含量与表面疏水性之间存在极显著负相关，与NSI和持水性存在极显著正相关，NSI与持水性之间呈极显著正相关。对WG而言，羰基含量与持水性之间存在极显著负相关，巯基含量与表面疏水性之间存在显著负相关，NSI与持水性呈显著负相关。综合而言，在储藏初期，蛋白质发生氧化，使巯基被氧化成二硫键，同时蛋白质分子结构伸展，埋藏在蛋白内部的疏水性基团暴露，导致表面疏水性和持油性增加，溶解度和持水性下降。随着储藏的进行，蛋白质氧化程度加深，巯基被氧化成不可逆的非二硫键的含硫化合物，暴露的疏水基团则在疏水相互作用下形成更多的不可溶性聚集体，影响蛋白质亲水/疏水基团的分布，导致表面疏水性、溶解度、持水性和持油性的降低。而氧化可能会使WG的谷蛋白大聚体解聚，蛋白质在水中更容易分散，导致其溶解度升高。蛋白氧化显著影响蛋白分子的结构和功能特性变化，从而影响组织化蛋白的品质。

表2 大豆分离蛋白储藏过程中各指标的Pearson系数

表3 大豆浓缩蛋白储藏过程中各指标的Pearson系数

表4 谷朊粉储藏过程中各指标的Pearson系数

3 结论

通过对原料进行加速储藏实验，在储存过程中，SPI、SPC和WG的功能特性和结构都有显著性变化。3种蛋白在储藏过程中均发生了不同程度的氧化，游离巯基含量逐渐减少，二硫键含量先增加后减少；同时由于蛋白结构伸展和疏水相互作用，使表面疏水性先增加后降低。SPI和SPC在储藏过程中NSI降低，WG的NSI逐渐增大。3种蛋白的持水性逐渐降低，而谷朊粉的吸水率。面筋蛋白的活性变化不显著。SPI和WG的持油性先升高后降低，SPC的持油性在加速储藏75 d(10个月)出现显著性下降，与表面疏水性变化趋势有关。

随着储藏的进行，谷朊粉加水后有散筋现象，影响其活性，但吸水率整体却没有显著性变化，谷朊粉结构变化与吸水率的关系有待进一步探究。同时，本实验室前期研究发现，生产以大豆分离蛋白为主的复配低水分组织蛋白的SPI合适的NSI值在66.11%～82.57%之间，SPC合适的NSI值在39.82%～50.10%之间，因此在加工生产组织化蛋白时，储藏的SPI建议不超过6个月，而SPC建议不超过4个月。为了防止谷朊粉散筋现象对组织化蛋白品质造成影响，WG建议现产现用。