基于花粉微观特征的木瓜品种孢粉学研究及亲缘关系分析

周冰谦 ，杨国红 ，卢 恒 ，宋祥云 ，刘 峰 ，2，耿岩玲 ，2，王 晓 ，2，刘 伟 ，2，李圣波

（1.齐鲁工业大学/山东省科学院，山东省分析测试中心，山东 济南 250014；2.齐鲁工业大学/山东省科学院药学院，山东 济南 250014；3.山东亚特生态技术股份有限公司，山东 临沂 276017）

中药木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles speciose （Sweet） Nakai 的干燥近成熟果实［1］，其气微清香，味酸，具有舒筋活络、和胃化湿功效，主要用于治疗湿痹拘挛、腰膝关节酸重疼痛、暑湿吐泻、转筋挛痛、脚气水肿。 中国作为木瓜属植物的起源中心，已有 3000 多年的栽培历史［2］，木瓜原生种全世界共有 5 种，有 4 种原产于中国［3］，其中载入《中国药典》的为皱皮木瓜（贴梗海棠），但临床上仍有其余几种混用的现象。 由于木瓜栽培具有分布广、品种多等特点，其被引种到自然分布区以外时，为了适应新的生态地理环境条件，外观形态会发生较大变化，因此出现木瓜同种间形状多样、鉴别困难等问题［4］。

花粉作为携带大量遗传信息的雄性生殖细胞，受基因型控制，是植物系统发育过程中较保守的器官，不易受外部自然环境影响［5］，因此可作为探讨植物起源进化、种属鉴别及亲缘关系鉴定的重要依据。本研究对采集的19 种木瓜花粉进行电镜扫描观察及系统聚类分析，以期为揭示木瓜的亲缘关系和中间分类鉴别提供孢粉学资料，并为木瓜药用植物新资源的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

用于孢粉学研究的19 种木瓜花均于2019 年4月10 日至11 日采自山东亚特药用植物生态园木瓜种质资源库，编号分别为YT001～YT004、YT012～YT013、YT018～YT021、YATS184～YATS185、YATS198～YATS199、YATS219、YATS336 及 YATS367～YATS369。原植物经山东中医药大学李佳教授鉴定为木瓜属。

1.2 方法

将19 种木瓜的全开花剥取花药置于薄层硫酸纸上，室温下阴干，将花粉均匀弹撒后，用双面导电胶固定在样品托上进行喷金处理，利用扫描电子显微镜，观察花粉性状、对称性、赤道面、极面观特征、花粉形状及外壁纹饰类型等特点，并随机选取花粉20 粒，测量极轴长（P）、赤道轴长（E）、萌发沟长，计算P/E 值。 根据观测结果，以供试的19 个品种作为分类运算单位进行系统聚类分析。

1.3 数据分析

利用 Screen Compass V4.0 软件进行花粉 P、E的测量，Excel 软件用于处理数据，SPSS 20.0 软件用于数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同种木瓜花粉显微形态特征分析

对不同种木瓜的花粉进行电镜扫描分析，结果表明发育良好的成熟木瓜花粉为单粒花粉，按照NPC分类系统［基于萌发器官的数目（N）、位置（P）和特征（C）的分类系统］进行对照，属于N3P4C3型，外形为超长球形或长球形，赤道面观为不规则长方形或椭圆形，极面观为三裂圆形或三裂椭圆形。 萌发器官为沿极轴方向的3 条等间距分布的孔沟，在赤道面可观察到2 条，在极面可以看到3 条，沟宽各异。见图1。

图1 木瓜花粉粒的显微电镜图

对19 种木瓜花粉进行显微形态特征观察及描述，P 为 28.25～51.11 μm，E 为 16.49～26.58 μm，P/E 值 1.24～2.40，萌发沟长/极轴长为 0.62～0.97。 外壁纹饰类型条纹-脑纹状纹饰或脑纹状纹饰，穿孔的数目不同。 见表 1、表 2。

表1 19 种木瓜样品的花粉形态特征

表2 19 种木瓜样品的花粉微观形态特征

2.2 木瓜花粉的聚类分析

对 19 种木瓜花粉的 P、E、P/E、萌发沟、萌发沟/极轴5 个定量指标及花粉形状、赤道面特征、极面观特征3 个定性指标进行聚类分析，得到谱系聚类图，见表4、图2。 在等级结合线L1 处 19 个品种被划分为3 大组，其中第Ⅰ类组中4 个品种（YT002、YATS184、YATS219、YATS367）与另外 4 个品种（YA TS198、YT018、YT003、YT001）紧密聚类，说明其亲缘关系近；第Ⅱ组包括 YT020、YT021、YATS185 及YATS336、YT012、YATS369、YT019，其中 YT020 与YT021 之间相似度更大，此结果与YATS336、YT012和YATS369 聚类结果相似，表明这3 种类型相似度最大，可能存在较近的亲缘关系；第Ⅲ组分类包括YT004、YATS368、YATS199 与 YT0139 聚成一类，其中 YT004、YATS368 和 YATS199 这三个品种紧密聚类，说明这三者间的相似度很大。 第Ⅱ组与第Ⅲ组之后在遗传距离15.0 处聚类，可知这两组其相似性有限；其后在遗传距离25.0 处与第Ⅰ组聚成一类，亲缘关系较远。

图2 19 种木瓜样品的花粉性状聚类分析图

表4 19 种木瓜样品的花粉聚类分析指标

3 讨论

花粉粒是种子植物雄蕊花粉囊内的粉状体［6］，其形态特征受植物基因型控制而不受外界环境的影响，具有极强的遗传保守性，其花粉大小、形状、表面雕纹及花粉壁结构作为重要的孢粉学分析指标比其他性状更稳定［7］，因此可以为植物系统分类学提供依据，是探讨植物起源、演化及亲缘关系的重要特征之一［8］。 目前公认花粉是按照由大到小的顺序进化，即相对原始的被子植物花粉体积相对较大，其花粉粒大小的范围为 50～99 μm［9］，有学者认为花粉随着植物由低等向高等的进化，形态由球形转变为超长球形［10］。 本研究中 19 种木瓜的花粉均属于 N3P4C3型，与前人研究结果具有一致性［8］。 且其花粉为超长球形或长球形，具有3 个萌发孔沟及条纹状的表面纹饰，在被子植物中属于进化较成熟的种群。 虽然

木瓜属各样品花粉在外壁纹饰、萌发孔位置、形状等方面的相似性表明其在属的水平上具有统一性，但P、E、P/E 等差异性表明其在遗传物质上存在不同，同属植物种间花粉形态特征的区别可作为区分植物的依据，因此对花粉微观结构的研究可为木瓜属植物的分类与鉴定提供基础数据。

在木瓜属花粉性状的聚类分析图中，供试木瓜属的19 个样品被划分为3 大类群，说明花粉性状可作为分类辅助方法［10］，同时该结果也客观反应出该属不同种之间的亲缘关系。 因此木瓜孢粉学亲缘关系可反映不同品种的分类地位，对揭示其亲缘关系有重要意义；此为山东药用木瓜植物资源的开发提供了依据。