LncRNA SNHG12在恶性脑胶质瘤中的表达水平及临床意义

邵颖颖，李 双，何淑芬，李灿涛，丁少波，何瑞荣

(1.南方医科大学附属东莞医院 药学部，广东 东莞523059；2.中南大学湘雅医院 临床药理研究所，湖南 长沙410008)

恶性脑胶质瘤是一种致死程度较高的恶性脑肿瘤，占成人原发性脑部肿瘤的80%[1]。现有的治疗手段主要以手术联合放化疗为主，虽然近年来此疾病的治疗手段有了明显提升，但是患者的预后仍不理想，中位生存时间只有14个月，五年内的存活率小于5%[2-3]。因此，寻找到预后生物标志物可以为此疾病的预后治疗提供新的思路。长链非编码RNA(Lnc RNA)是一种长度大于200nt的RNA分子，在细胞生长分化、细胞周期调控、细胞凋亡、迁移侵袭、免疫反应等多种生命活动中均发挥重要作用[4]。其中，小核仁RNA宿主基因12(SNHG12)在多种癌症中均有异常表达[5-10]，且在脑胶质瘤中已有报道显示其与此疾病病理分级、不良预后有关[11]，本研究结合公共生物信息数据库中以及国内医院收集到的病例样本信息，通过探讨LncRNA SNHG12在脑胶质瘤中的表达水平，分析其是否可作为脑胶质瘤预后良好指标。

1 资料与方法

1.1 数据库样本数据收集根据研究目的与研究内容确定研究样本的筛选标准为样本数较大，至少大于50例且有正常对照组的数据集，据此标准从GEO数据库下载GSE4290数据集，对其中23例正常脑组织样本(癫痫患者脑组织)和153例恶性脑胶质瘤样本中LncRNA SNHG12表达进行相关数据分析，同时，对从TCGA数据库中下载的614例恶性脑胶质瘤患者的LncRNA SNHG12表达进行分析。并且，从GEO数据库下载GSE4271数据集以及TCGA数据库中下载恶性脑胶质瘤患者的临床病理资料进行整理，分析LncRNA SNHG12表达对恶性脑胶质瘤患者预后的影响。

1.2 临床资料选取2007 年至 2013 年在湖南省中南大学附属湘雅医院的91例Ⅰ-Ⅳ级恶性脑胶质瘤患者和12例脑外伤患者或癫痫患者。本研究样本采集获得中南大学湖南省重点实验室临床药理研究所独立伦理委员会的伦理批件(CTXY-1300041-3)，患者或家属知情同意并签署知情同意书。

1.3 纳入与排除标准

1.3.1纳入标准 (1)2007年至2013年在湖南省中南大学附属湘雅医院新诊治为多形性胶质母细胞瘤，并经该院神经疾病病理科根据2007年版的胶质瘤分级指南确诊；(2)行根治性手术，术前未行任何放射性治疗、化学药物治疗以及手术治疗；(3)随访资料以及病例信息均完整；(4)患者知情并自愿同意参加本研究，签署知情同意书。

1.3.2排除标准 (1)复发性胶质瘤患者；(2)初次手术后行放射性治疗、化学药物治疗以及手术治疗的胶质瘤患者；(3)死于除了肿瘤进展病因之外原因的胶质瘤患者；(4)病例信息或随访资料不完整。

1.4 随访采用门诊或者电话的方式进行随访，随访时间为患者确诊后的1-60个月，如果患者死亡随访时间结束。

1.5 主要试剂与仪器Trizol(美国Invitrogen公司，批号：15596018)；氯仿(批号：67-66-3)，异丙醇(批号：67-63-0)，乙醇(批号：64-17-5)均购自国药集团化学试剂有限公司；RNA反转录试剂盒 PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa，批号：RR037A)；SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(美国Invitrogen公司，批号：C11744-100)；引物由上海博尚生物科技有限公司合成。核酸浓度测定仪Nanodrop 2000(美国Thermoscientific公司)；普通PCR扩增仪AG6321(德国Eppendorf公司)；实时荧光定量 PCR 仪(Roche LC480公司，瑞士)；低温高速离心机(Eppendorf公司，德国)。

1.6 方法

1.6.1RNA的提取 取脑胶质瘤组织和正常脑组织解冻后，超声匀浆，加入1 ml Trizol试剂，充分混匀后室温静置10 min；加入200 μl氯仿上下颠倒10次并在振荡器上振荡15 s，静置5 min待充分乳化或呈乳白色后在4℃，12 000 g离心15 min；小心吸取收集上层无色水相层于新的1.5 ml EP管中并加入500 μl异丙醇，上下颠倒10次充分混匀室温静置10 min后4℃，12 000 g离心15 min；轻轻倒去上清加入1 ml无水乙醇慢慢加至EP管中(注意勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒10次后4℃，12 000 g离心5 min，重复操作一次后弃去上清，置于室温干燥15 min后加入合适量(约20 μl)DEPC水溶解RNA，待溶解完全后保存在-80℃超低温冰箱中备用。

表1 引物序列

1.7 统计学方法采用SPSS 18.0软件(IBM,SPSS,Chicago,IL)进行一般统计分析。所有数据以均数±标准差表示。采用Student’st检验比较脑胶质瘤组织与正常脑组织样本间LncRNA SNHG12的表达水平。LncRNA SNHG12表达水平与临床病理特征的关系采用皮尔逊卡方检验或费舍尔精确检验。采用Kaplan-Meier法和log-rank检验法来比较计算总生存率。临床病理特征变量和LncRNA SNHG12表达水平对总生存率的影响通过单变量和多变量分析进行评估。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA SNHG12在脑胶质瘤组织以及正常脑组织中的表达水平比较对从GSE4290和TCGA数据库中下载的样本的表达数据进行分析，结果显示LncRNA SNHG12在脑胶质瘤中的表达水平明显高于正常脑组织，且随着脑胶质瘤恶性程度的升高而升高，见图1。采用qRT-PCR法对从湖南省湘雅医院收集到的91例Ⅰ-Ⅳ 级恶性脑胶质瘤组织和12例正常脑组织中LncRNA SNHG12的表达水平进行检测，结果发现，与正常脑组织相比，脑胶质瘤组织中LncRNA SNHG12呈现高表达水平，且与数据库中的样本分析结果一致，也随着胶质瘤病理等级的升高而升高，见图2。

图1 LncRNA SNHG12在GSE4290和TCGA数据库中的表达差异

图2 LncRNA SNHG12在胶质瘤中高表达与胶质瘤病理分级相关

2.2 LncRNA SNHG12表达与脑胶质瘤患者临床病理特征的关系在对湘雅医院收集的恶性脑胶质瘤患者的临床病例资料进行进一步分析，以脑胶质瘤患者LncRNA SNHG12表达水平均值为分界线，高于平均值为高表达，低于平均值为低表达。脑胶质瘤组织中LncRNA SNHG12表达情况与患者年龄、性别、病灶位置无关(P值分别是0.437,0.580,0.203)，与患者病理分级有关(P<0.001)，见表2。

2.3 影响脑胶质瘤患者预后因素的Cox回归分析为评估LncRNA SNHG12表达对胶质瘤患者的预后价值，进一步对湘雅医院收集的恶性脑胶质瘤患者的临床病例资料进行Cox模型多因素分析结果显示LncRNA SNHG12过表达(HR=0.161,95% CI=0.083-0.312,P<0.001)，肿瘤分级(HR=0.381,95% CI:0.220-0.659,P=0.001)和病灶位置(枕骨vs.颞部)(HR=0.211,95% CI=0.048-0.928,P=0.039) 是影响脑胶质瘤预后的危险因素。Cox比例风险模型多因素分析结果显示，LncRNA SNHG12的表达水平(HR=0.173,95% CI=0.084-0.358,P<0.001)和肿瘤分级(HR=0.458,95% CI=0.242-0.868,P=0.017) 是影响脑胶质瘤患者生存的独立预后指标 ，见表2。

表2 LncRNA SNHG12与脑胶质瘤患者临床病理特征的关系

2.4 LncRNA SNHG12表达水平与脑胶质瘤患者预后的关系根据LncRNA SNHG12表达的中位数，分为高表达组和低表达组。结果显示，在TCGA(图3A)和GSE4271(图3B)数据集中，LncRNA SNHG12的高表达均与胶质瘤患者的预后生存不佳相关。为了进一步评估验证这一结果，对湘雅医院收集的91例病人样本进行同样的分析，结果显示与前述数据库中分析结果一致，脑胶质瘤患者中LncRNA SNHG12高表达者的总存活率显著低于低表达患者的总存活率(HR=1.984,95% CI=0.809-4.865,P<0.0001)(图3C)。

图3 LncRNA SNHG12在胶质瘤中的表达水平与患者预后的关系

3 讨论

近年来，发现和识别用于诊断、治疗和预后的潜在生物标志物已成为改善癌症患者生存状态不佳的重要途径。越来越多的证据表明，LncRNA参与了多种生物学过程包括细胞的生长、周期调控、凋亡以及癌症在内的多种疾病的发生发展过程[12]。随着基因芯片技术的发展，越来越多的LncRNA被鉴定为癌症患者的潜在生物标志物和治疗靶点。脑胶质瘤作为一种5年生存率极低的恶性肿瘤，迫切需要新的预后标志物和治疗靶点[13]。

研究表明，LncRNA在脑胶质瘤的发生发展中发挥重要作用[14-16]。Ruan W.等阐明了LncRNA SNHG12通过诱导AMOT基因过表达促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移[17]。Lan等发现LncSNHG12在肝癌细胞中可以通过竞争性结合miR-199 a/b-5p而间接影响NF-κB通路来调控肝癌细胞的凋亡和迁移[18]。在结直肠癌中，上调的LncRNA SNHG12可以通过抑制癌细胞凋亡从而促进结直肠癌的发生与发展[19]。近年来，在脑胶质瘤的研究中虽已有报道显示LncRNA SNHG12与此疾病病理分级、不良预后有关[20]，本研究通过对GEO数据库、TCGA数据库中以及从湘雅医院收集到的患者病例资料信息以及qRT-PCR检测LncRNA SNHG12表达水平进行分析，在不同人种不同国家地区来源的恶性脑胶质瘤患者中LncRNA SNHG12的表达水平显著高于正常脑组织，且在高级别病理分级的恶性脑胶质瘤组织中的表达水平显著高于低级别(P<0.05)；且LncRNA SNHG12高表达的恶性脑胶质瘤患者的总存活率显著低于低表达患者(HR=1.984,95% CI=0.809-4.865,P<0.0001)。在对湘雅医院收集的恶性脑胶质瘤患者的临床病例资料进行进一步分析发现，在恶性脑胶质瘤组织中LncRNA SNHG12的表达情况与患者年龄、性别以及病灶位置无关(P值分别是0.437,0.580,0.203)，与患者的肿瘤病理分级有关(Ⅰ-Ⅱ级 vs.Ⅲ-Ⅳ级,P<0.0001)；Cox模型多因素分析结果显示，患者的肿瘤病理分级是影响恶性脑胶质瘤患者预后的独立危险因素(HR=0.173,95% CI=0.084-0.358,P<0.001)。因此，结合公共数据库样本以及医院收集的临床样本信息，对国内外患者进行统一分析后认为LncRNA SNHG12可能成为胶质瘤患者潜在预后疗效的生物标志物且不受人种地域等条件的限制，具有普适性。