HPLC法测定罗氟司特粗品有关物质及新化合物的发现

徐 谦，徐陈凤，邹巧根，孙莉莉

(1.南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 211800；2.南京海纳医药科技股份有限公司，江苏 南京 210009)

罗氟司特(CAS号：162401-32-3)，化学名为3-(环丙基甲氧基)-N-(3,5-二氯吡啶-4-基)-4-(二氟甲氧基)苯甲酰胺，能选择性抑制磷酸二酯酶-4(PDE4)，阻断炎症反应信号的传递，进而抑制如慢性阻塞性肺疾病(COPD)和哮喘等呼吸道疾病对肺组织造成的损伤[1]。罗氟司特是新型的COPD治疗药物，可用于治疗严重COPD患者支气管炎相关咳嗽和黏液过多的症状，目前国内尚未有罗氟司特片上市。本文参考张莉等[2]、闫文娜等[3]、Deosthalee等[4]和刘婷等[5]的研究成果，结合罗氟司特合成路径及其结构，采用键和苯基的C18柱建立的色谱方法，对罗氟司特中可能存在的杂质进行定量分离分析，以期对罗氟司特合成及分析过程中的质量控制提供参考。

图1 罗氟司特合成路径Fig.1 Synthesis route of roflumilast

1 仪器与方法

Agilent 1220液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；分析天平，天津市天马衡基仪器有限公司。

罗氟司特粗品、罗氟司特对照品及罗氟司特杂质对照品IMP1～IMP7，其中罗氟司特粗品及杂质对照品IMP1～IMP7的纯度分别为：99.81%、99.69%、99.06%、98.98%、98.11%、98.67%、99.18%和98.87%，购自南京市海纳医药股份有限公司；水为自制超纯水；其余试剂均为色谱级。

1.1 色谱条件

采用Welch的Ultimate Phenyl-Ether色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相A为0.01 mol/L的KH2PO4，流动相B为乙腈，进行梯度洗脱，洗脱梯度见表1，检测波长为215 nm，柱温为25 ℃，进样量为10 μL，流速为1.0 mL/min。

1.2 溶液的制备

1.2.1 罗氟司特对照品溶液的配制

精密称取罗氟司特对照品适量，加体积比为60∶ 40的乙腈和水混合溶液溶解，并稀释至1.0 mg/mL，作为对照品溶液。

表1 洗脱梯度

1.2.2 罗氟司特供试品溶液的配制

精密称取罗氟司特粗品适量，加体积比为60∶ 40的乙腈和水混合溶液溶解，并稀释至1.0 mg/mL，作为供试品溶液。

1.2.3 杂质对照品溶液的配制

精密称取罗氟司特各杂质对照品IMP1～IMP7适量，加体积比为60∶ 40的乙腈和水混合溶液溶解，并稀释至1.0 mg/mL，作为杂质对照品溶液。

1.2.4 专属性的考察

1.2.4.1 光照破坏的考察

取1 mL罗氟司特对照品溶液于10 mL容量瓶，置于(4 500±500)lx强光下照射24 h后，加体积比为60∶ 40的乙腈和水混合溶液稀释至刻度线，作为光破坏试验的供试液。

1.2.4.2 高温破坏的考察

取1 mL罗氟司特对照品溶液于10 mL容量瓶，置于90 ℃水浴24 h后冷却，加体积比为60∶ 40的乙腈和水混合溶液稀释至刻度线，作为高温破坏试验供试液。

1.2.4.3 酸破坏的考察

取1 mL罗氟司特对照品溶液于10 mL容量瓶，加入1.0 mol/L的HCl溶液1 mL，分别在25和90 ℃水浴中放置8 h，加入1.0 mol/L的NaOH溶液1 mL中和至中性，加体积比为60∶ 40的乙腈和水混合溶液稀释至刻度线，作为酸破坏试验的供试液。

1.2.4.4 碱破坏的考察

取1 mL罗氟司特对照品溶液于10 mL容量瓶，加入1.0 mol/L的NaOH溶液1 mL，分别在25和90 ℃水浴中放置8 h，加入1.0 mol/L的HCl溶液1 mL中和至中性，加体积比为60∶ 40的乙腈和水混合溶液稀释至刻度线，作为碱破坏试验的供试液。

1.2.4.5 氧化破坏的考察

取1 mL罗氟司特对照品溶液于10 mL容量瓶，加入1.0 mol/L质量分数30% H2O2溶液1 mL，分别在25和90 ℃水浴中放置8 h，加体积比为60∶ 40的乙腈和水混合溶液稀释至刻度线，作为氧化破坏试验的供试液。

1.2.5 检测限(LOD)和定量限(LOQ)的考察

分别取罗氟司特对照品溶液和杂质对照品溶液，用体积比60∶ 40的乙腈和水溶液逐级稀释，以信噪比(S/N)=3确定罗氟司特的LOD，以S/N=10确定其LOQ。

1.2.6 线性关系的考察

分别取罗氟司特对照品溶液和杂质对照品溶液，体积比60∶ 40的乙腈和水溶液稀释成质量浓度约为10 μg/mL的溶液作为线性母液。取线性母液0.3、0.5、0.8、1.0、1.2、2.0、2.5和3.0 mL至10 mL容量瓶中，用体积比为60∶ 40的乙腈和水混合溶液定量。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，并计算罗氟司特各杂质的相对校正因子。

1.2.7 精密度的考察

分别取1 mL罗氟司特对照品溶液和杂质对照品溶液于10 mL容量瓶，加体积比为60∶ 40的乙腈和水混合溶液稀释至刻度线，样品连续进样6次，计算罗氟司特和IMP1～IMP7峰面积的相对标准偏差(RSD)值。

1.2.8 重复性的考察

分别取1 mL罗氟司特对照品溶液和杂质对照品溶液于10 mL容量瓶，加体积比为60∶ 40的乙腈和水混合溶液稀释至刻度线，重复测定3次，计算罗氟司特和IMP1～IMP7的RSD值。

1.2.9 稳定性的考察

取新鲜配制的罗氟司特对照品溶液和杂质对照品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h取1 mL于10 mL容量瓶，加体积比为60∶ 40的乙腈和水混合溶液稀释至刻度线，进样后记录色谱图并比较峰面积，计算罗氟司特和IMP1～IMP7的RSD值。

1.2.10 回收率的考察

称取罗氟司特10 mg于10 mL容量瓶中，共9份。按杂质限度的80%、100%和120%加入杂质，每个浓度分别取3份，加体积比为60∶ 40的乙腈和水混合溶液稀释至刻度线，进样测得IMP1～IMP7的平均回收率。

1.2.11 杂质来源的考察

将各杂质对照品溶液等比混合，用体积比为60∶ 40的乙腈和水混合溶液稀释成100 μg/mL的溶液进样，对样品杂质来源进行分析。

2 结果与讨论

2.1 专属性的考察结果

分别取1.2.4项中破坏试验供试液，按照1.1项中的色谱方法进样检测，结果见图2。由图2可知：罗氟司特在室温及高温下的酸、碱和氧化条件下都较为稳定，并未产生降解杂质，与文献[3-5]报道的结果一致。说明在温度为90 ℃时，酸、碱和氧化条件下可检测到降解产物。

图2 专属性色谱Fig.2 Chromatograms of specificity test

2.2 LOD和LOQ的考察结果

以1.2.5项中方法确定罗氟司特及IMP1～IMP7的LOD分别为0.05、0.01、0.02、0.03、0.08、0.06、0.08和0.03 μg/mL，以S/N=10确定其LOQ分别为0.18、0.04、0.08、0.10、0.27、0.20、0.28和0.09 μg/mL。

2.3 线性关系的考察结果

按1.2.6项中方法进行线性回归，并计算罗氟司特与各杂质的相对校正因子，得到回归方程，结果见表2。

由表2可知：罗氟司特和IMP1～IMP7质量浓度在0.294～3.022 μg/mL范围内质量浓度与峰面积的线性关系均为良好。

表2 罗氟司特及其杂质线性范围和校正因子

2.4 精密度的考察结果

按1.2.7项中方法计算得罗氟司特和IMP1～IMP7峰面积的RSD值分别为0.23%、0.62%、0.33%、0.37%、0.25%、0.44%、0.57%和0.43%，说明其精密度良好。

2.5 重复性的考察结果

按1.2.8项中方法计算罗氟司特和IMP1～IMP7的RSD值分别为0.53%、0.28%、0.57%、0.63%、0.39%、0.24%、0.61%和0.37%，说明其重复性良好。

2.6 稳定性的考察结果

按1.2.9项中方法计算罗氟司特和IMP1～IMP7的RSD值分别为0.35%、0.42%、0.62%、0.28%、0.33%、0.62%、0.56%和0.42%。说明罗氟司特对照品溶液和杂质对照品溶液在室温下放置24 h后依然稳定。

2.7 回收率的考察结果

按1.2.10项中方法，进样测得粗品和IMP1～IMP7的平均回收率分别为98.6%、99.2%、99.3%、100.5%、98.7%、99.9%、98.0%和100.3%；RSD值分别为0.41%、0.58%、0.41%、0.28%、0.39%、0.61%、0.45%和0.33%。

2.8 杂质的考察结果

2.8.1 杂质的HPLC分析结果

将各杂质对照品溶液等比混合，用体积比为60∶ 40的乙腈和水混合溶液稀释成100 μg/mL 的溶液后，进样进行HPLC的分析，结果见图3。

图3 杂质混合溶液的分析Fig.3 Analysis of mixed solution of impurities

由图3可知：杂质混合溶液中7种杂质分离度良好。本研究中罗氟司特粗品中被检测到的杂质有3种，分别为IMP4、IMP5和IMP7。这3种杂质的HPLC分析见图4。

图4 罗氟司特粗品的分析Fig.4 Analysis of roflumilast crude

2.8.2 杂质来源的分析结果

IMP1～IMP7定位及来源见表3。由表3可知：IMP1为起始物料，IMP2为酸降解杂质，IMP3为碱降解杂质，IMP4为杂质参与后续反应所产生的副产物，IMP5及IMP7为杂质与后续反应所产生的副产物，IMP6为反应中间体2的残留物。

表3 罗氟司特及各杂质结构及来源

2.8.3 IMP4杂质的分析结果

IMP4为本文首次报道的新杂质，其产生路径为原料中杂质参与后续反应被引入的副产物。IMP4的产生路径(图5)及其核磁共振氢谱(NMR-H)、核磁共振碳谱(NMR-C)见图6～7。由图6～7可知：IMP4正离子模式下的质荷比(m/z)为447.0。

图5 IMP4的产生路径Fig.5 Route of production of IMP4

图6 IMP4的核磁共振氢谱Fig.6 NMR-H spectrum of IMP4

图7 IMP4的核磁共振碳谱Fig.7 NMR-C spectrum of IMP4

3 结论

在罗氟司特粗品中分离出3个杂质，其中杂质IMP4未见相关报道，该杂质及相关化合物及产生路径均为首次报道，其结构经过质谱、核磁共振氢谱及碳谱确证。IMP4与罗氟司特的化学结构相差不大，采用一般的C18色谱柱难以进行有效分离，本文采用的色谱方法能有效分离包括IMP4在内的多个杂质。

综上，本文所用色谱方法能有效分离罗氟司特与其可能存在的杂质，此方法的专属性、精密度和重复性等均为良好。本研究从罗氟司特的合成及过程分析，推测其潜在杂质，能为罗氟司特的合成及质量控制过程提供参考。