8种食用菌蛋白及其酶解产物抗氧化活性研究

王耀冉 赵 妍 陈明杰 魏晨颖 查 磊 李治平

(1. 上海市农业科学院食用菌研究所上海市农业遗传育种重点开放实验室，上海 201403； 2. 上海海洋大学食品学院，上海 201306)

自由基在人类正常生理反应中不断产生，且具有多种功能，如信号传导、抗感染[1-2]等。然而，过量的自由基会引发氧化应激从而改变DNA、蛋白质和脂质的结构并影响信号转导，因此，自由基在癌症、动脉粥样硬化、糖尿病和高血压等人类疾病的病因中起着至关重要的作用[3]。抗氧化剂则可通过干预氧化应激介导的途径来减少生物分子的氧化损伤[4]。

抗氧化肽属天然蛋白质，是通过体内的胃肠道消化、体外酶解或微生物发酵后释放出来的生物活性肽，在机体抗氧化中起着重要作用。如从金枪鱼骨架蛋白水解获得的抗氧化肽APTBP可显著抑制亚油酸乳液体系中脂质的过氧化[5]；由鸭蛋卵清蛋白制备的酶解产物同时具有抗氧化和免疫调节的活性[6]；油豆角蛋白酶解产物具有防治炎症和与氧化相关疾病的作用[7]。

根据美国农业部提供的数据[8]显示，食用菌中蛋白质含量丰富，高于大多数蔬菜。大量研究[9-11]也证实食用菌富含多种抗氧化剂，包括多糖、酚类、蛋白质、多肽、麦角甾醇等。因此，食用菌为抗氧化肽的发现提供了理想的物质基础。据Zhou等[12]、Erjavec等[13]综述，食用菌含有丰富的生物活性蛋白质尤其是酶已被广泛研究，然而关于食用菌源生物活性肽的研究报道很少。研究拟利用碱性蛋白酶对8种食用菌蛋白进行酶解，并综合评价食用菌蛋白及其酶解产物的抗氧化活性，分析酶解产物的氨基酸组成，为食用菌源抗氧化肽的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

香菇、平菇、杏鲍菇、红菇：上海市佳客多超市；

大球盖菇、草菇、白玉菇、蟹味菇：上海市农业科学院食用菌研究所；

碱性蛋白酶：200 U/mg，上海麦克林生化科技有限公司；

DPPH自由基清除能力试剂盒：苏州格锐思生物科技有限公司；

ABTS自由基清除率检测试剂盒、Bradford蛋白浓度测定试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

恒温水浴锅：HWS-24型，上海一恒科技有限公司；

多功能酶标仪：TECAN Infinite 200 Pro型，瑞士TECAN公司；

离心机：R-134 a型，德国Eppendorf公司；

超纯水机：Milli-Q Reference A+型，德国MerckMillipore公司；

氨基酸自动分析仪：Hitachi L-8900型，日立有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品准备 将新鲜的食用菌子实体清洗干净，切片后于40 ℃烘箱中烘干至恒重，磨成粉过60目筛。粉末用密封袋包装后于-80 ℃保存。

1.2.2 蛋白质的提取 将食用菌粉与超纯水按照m食用菌粉∶V超纯水=1∶10的比例混匀，静置4 h。将浆液在4 ℃、8 000 r/min离心20 min，取上清液，加入80%硫酸铵，4 ℃、8 000 r/min离心20 min获得沉淀物。将沉淀物用双蒸水溶解，转移至透析袋(10 kDa)中，在4 ℃下用蒸馏水透析48 h脱盐，将透析液冻干并储存于-80 ℃超低温冰箱内。

1.2.3 蛋白酶解产物的制备 将食用菌蛋白质溶解于双蒸水中，调节温度与pH至碱性蛋白酶最佳作用条件(45 ℃、pH 7.5)，平衡30 min。按照底物质量的4%添加碱性蛋白酶，酶解4 h后在90 ℃下加热15 min以终止反应，8 000 r/min离心15 min，取上清液冻干得到蛋白酶解产物。

1.2.4 蛋白浓度的测定 按Bradford蛋白浓度测定试剂盒要求测定。取5 μL不同浓度的牛血清蛋白(BSA)加到96孔板中；取5 μL样品到96孔板中；各孔加入250 μL G250染色液；用酶标仪测定595 nm处吸光度值；绘制标准曲线并根据标准曲线计算样品蛋白质的浓度。

1.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳 将16 μL样品与4 μL上样缓冲液混合，沸水浴中加热4 min，冷却至室温。取10 μL 混合液上样至凝胶(质量分数10%)上进行电泳，结束后用考马斯亮蓝染色1 h，然后用脱色液脱色至蛋白条带清晰可见，并在凝胶成像仪上拍照分析。

1.2.6 氨基酸组成分析 称取食用菌蛋白酶解液冻干粉20 mg，加入0.5 mL 0.1 mol/L的盐酸，10%三氯乙酸，在研磨仪60 Hz下研磨3 min，超声提取15 min，4 ℃、12 000 r/min 离心30 min，取上清液，放入氨基酸自动分析仪进行检测。

1.2.7 抗氧化活性测定

(1) ABTS自由基清除活性(ARSA)：配制ABTS自由基工作液，在96孔板中，每孔加入20 μL过氧化物酶工作液，10 μL样品或不同浓度Trolox标准溶液，170 μL ABTS工作液。室温下孵育6 min，测定414 nm 处吸光度值，根据标准曲线计算ARSA值。

(2) DPPH自由基清除活性(DRSA)：在离心管中分别加入150 μL样品溶液，150 μL乙醇DPPH溶液，混匀后在室温下避光静置30 min，12 000 r/min离心5 min，测定517 nm处吸光度。利用标准品绘制标准曲线，根据样品测得的吸光度来计算DRSA值。

(3) Fe2+螯合率：参照马梦娇[14]的方法。在1 mL样品溶液中加入3.7 mL双蒸水、0.1 mL 2 mmol/L的FeCl2溶液和0.2 mL 5 mmol/L菲咯嗪，25 ℃下反应10 min，测定562 nm处吸光度A1。蒸馏水代替样品测得吸光度为A0，蒸馏水代替菲咯嗪测得吸光度为A2。按式(1) 计算Fe2+螯合率。

(1)

式中：

C——Fe2+螯合率，%；

A1——样品溶液的吸光度值；

A2——蒸馏水代替菲咯嗪测得的吸光度值；

A0——蒸馏水代替样品测得的吸光度值。

(4) 还原力的测定：参照Dong等[15]的方法并略作修改。往500 μL样品中添加500 μL 0.2 mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.6)和500 μL 10 g/L铁氰化钾，将混合物于50 ℃下水浴20 min，加入500 μL 100 g/L三氯乙酸，8 000 r/min离心10 min得上清液。将500 μL上清液、500 μL双蒸水和100 μL 1 g/L氯化铁溶液混合，在室温下反应10 min，测定700 nm处溶液的吸光度。吸光度越大说明样品的还原能力越强。

1.3 数据分析

所有试验均重复3次。使用SPSS软件进行数据分析，P<0.05时差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE电泳图谱分析

由图1可知，未水解的蛋白质由10～175 kDa及以上的分子量条带组成。将食用菌的蛋白质条带与其酶解产物的条带进行对比，发现碱性蛋白酶可有效地将8种食用菌蛋白水解为更小分子量的肽段甚至是氨基酸。

M. 标准蛋白marker 1，3，5，7，9，11，13，15. 分别为大球盖菇、香菇、草菇、红菇、白玉菇、蟹味菇、平菇、杏鲍菇蛋白 2，4，6，8，10，12，14，16. 分别为大球盖菇、香菇、草菇、红菇、白玉菇、蟹味菇、平菇、杏鲍菇蛋白酶解产物

2.2 酶解产物氨基酸组成分析

据报道[16]，His具有很强的抗氧化活性，这与其供氢能力、脂质过氧化自由基捕捉和咪唑基团的金属离子螯合能力有关。由表1可知，平菇蛋白酶解产物中His含量最高，为(10.85±0.19) mg/g，表明其可能具有较好的抗氧化活性。研究[17-18]表明，疏水性氨基酸增强了多肽在脂质中的溶解性，从而增强了多肽与自由基的相互作用或通过疏水缔合进入靶器官的作用；带负电荷的氨基酸可以赋予多肽较高的抗氧化活性，这些电子可以用来猝灭自由基；芳香族氨基酸通过供氢来稳定缺电子的自由基，这一特性可改善多肽的自由基清除活性。草菇蛋白酶解产物的疏水性氨基酸、负电荷氨基酸以及芳香族氨基酸含量在8种食用菌中均最高，分别为(209.95±4.95),(115.89±2.32),(57.86±1.74) mg/g。草菇蛋白酶解产物还含有丰富的必需氨基酸，而且作为很多食物的第一限制性氨基酸的Lys含量也最高。因此，草菇蛋白酶解产物有着良好的营养价值和抗氧化潜力。

表1 8种食用菌蛋白酶解产物的氨基酸组成†

2.3 食用菌蛋白及其酶解产物的抗氧化活性

2.3.1 ABTS自由基清除能力 由图2可知，8种食用菌的蛋白酶解产物比未酶解蛋白质ABTS自由基清除能力高，其中草菇蛋白水解产物的ABTS自由基清除能力最高，为(6.97±0.27) mmol Trolox/L。这表明蛋白质经酶解后，ABTS自由基的抑制率显著增加。

2.3.2 DPPH自由基清除能力 由图3可知，8种食用菌蛋白酶解产物对DPPH自由基的清除能力均显著高于其各自的蛋白质，其中红菇蛋白酶解产物的DPPH自由基清除能力最高，为(5 668.22±6.16) μg Trolox/g。草菇和平菇蛋白酶解产物也具有较高的DPPH自由基清除能力，分别为(5 140.45±5.35) μg Trolox/g和(4 934.66±50.70) μg Trolox/g。蛋白质经酶解后可能会产生更多的生物活性底物，这些底物提供电子并与自由基反应，将其转化为更为稳定的物质，从而终止了自由基链反应[19]，与GHRIBI等[20]的研究结果一致。

2.3.3 Fe2+螯合率 过渡金属离子(例如Fe2+和Cu2+)是生成自由基的强力剂，这些自由基可以催化活性氧的生成，例如羟自由基和超氧阴离子自由基等[21]。金属离子的存在会很快消耗抗氧化剂，导致脂质过氧化和DNA损伤[22]。Fe2+可与菲咯嗪形成复合物，在螯合剂存在的情况下，复合物的形成被破坏，导致复合物的红色减少[23]。由图4可知，食用菌蛋白酶解产物的Fe2+螯合能力高于食用菌蛋白质，其中草菇蛋白酶解产物的Fe2+螯合能力最高(79.86±0.45)%。阳性对照EDTA的Fe2+螯合率为(99.93±0.01)%。多肽具有较强的Fe2+螯合能力可能是由于肽键的断裂暴露出了更多的酸性和碱性氨基酸，这样侧链的羧基和氨基可以结合Fe2+[24]。

2.3.4 还原力 根据抗氧化剂的还原能力不同，测试溶液由黄色变成不同深浅的绿色和蓝色[25]。如图5所示，阳性对照GSH还原力最高为2.720±0.018，食用菌蛋白及其酶解产物的还原力显著低于GSH，其中草菇蛋白酶解产物的还原能力最高为0.350±0.001。这些食用菌蛋白酶解产物还原能力的不同，可能与不同的氨基酸侧链基团有关，随着蛋白质酶解的进行，具有电子密集区域的氨基酸侧链基团会更多地暴露出来。此外，多肽和游离氨基酸作为额外的电子和质子源可以维持还原电位[26]。具有还原能力的化合物可以作为初级和次级抗氧化剂，因为它们属于电子供体，很容易减少脂质过氧化过程中的中间产物自由基，这些抗氧化还原剂的存在将Fe3+/铁氰化物复合物转化或还原为亚铁形式(Fe2+)。而Fe2+的浓度由基于700 nm处形成的普鲁士蓝检测出来[27]。

1. 大球盖菇 2. 香菇 3. 草菇 4. 红菇 5. 白玉菇 6. 蟹味菇 7. 平菇 8. 杏鲍菇

1. 大球盖菇 2. 香菇 3. 草菇 4. 红菇 5. 白玉菇 6. 蟹味菇

1. 大球盖菇 2. 香菇 3. 草菇 4. 红菇 5. 白玉菇 6. 蟹味菇

1. 大球盖菇 2. 香菇 3. 草菇 4. 红菇 5. 白玉菇 6. 蟹味菇

3 结论

以蒸馏水作为提取溶剂，采用硫酸铵沉淀法提取蛋白质，用碱性蛋白酶对8种食用菌(香菇、平菇、杏鲍菇、红菇、大球盖菇、草菇、白玉菇、蟹味菇)蛋白进行酶解，发现草菇蛋白酶解产物的抗氧化活性最强，DPPH自由基清除能力为(5 140.45±5.35) μg Trolox/g，ABTS自由基清除能力为(6.97±0.27) mmol Trolox/L，Fe2+螯合率为(79.86±0.45)%，还原力为0.350±0.001。

对食用菌蛋白酶解产物进行研究有助于开发低价值蛋白质在功能性食品或化妆品领域的潜在应用。食用菌富含优质蛋白质，以此为源制备生物活性肽，可以进一步提升食用菌蛋白的高值化应用。在后续的研究中，还需要对蛋白酶解产物进行纯化和鉴定，并开展细胞和体内的试验以探究其可能的作用机制。