ACTN4、HPV16 E7检测在食管癌患者诊断及预后判断中的价值

王 力，邸 静

商洛国际医学中心医院病理科，陕西商洛 726000

食管癌是一种发生在食管上皮的消化道恶性肿瘤，因病理类型的差异而有所不同，在我国发病率较高，仅次于胃癌，但食管癌的病因与发病机制迄今尚不明确。据统计，我国每年约有15万人因食管癌而死亡，由于食管癌在早期症状较轻，除吞咽有哽噎感外无其他不适，因此多被患者所忽视，影响了治疗时间，这也是造成食管癌病死率较高的原因之一[1]。食管是幽门螺杆菌感染的必经之路，也是与人乳头瘤状病毒(HPV)感染有关的原因之一，近年来HPV与食管癌之间的关系逐渐被人们重视[2]。α-辅肌动蛋白4(ACTN4)作为血影蛋白超家族的成员，是一种膜相关骨架蛋白的肌动蛋白，可参与细胞骨架重组以及调节细胞黏附及形态，通过与肌动蛋白相结合保持细胞骨架完整性和调节细胞运动[3]。相关研究发现，ACTN4与多种肿瘤的发生、发展及侵袭转移密切相关，且ACTN4表达降低后可显著抑制包括口腔鳞状细胞、脑胶质瘤细胞、星形细胞瘤细胞在内的多种肿瘤的活性[4]。但目前对ACTN4在食管癌发生发展中所起的作用以及与临床指标的相关性方面还少有证实。本研究通过免疫组化检测HPV16 E7、ACTN4在食管癌组织中的表达，并分析其与食管癌患者临床病理特征和术后生存期的关系，旨在为HPV16 E7、ACTN4在食管癌发生、发展中的作用以及食管癌的诊断提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年1月至2019年5月在本院进行食管癌手术治疗的80例患者为研究对象，食管癌病理组织及癌旁2 cm正常组织均保存于本院病理科。纳入标准：接受手术治疗的原发性食管癌，初次手术，术前未接受全身治疗。排除标准：无明确病理诊断，化学疗法治疗者，语言障碍及存在精神障碍者，客观或主观原因退出者。所有患者中位年龄55岁，<55岁和≥55岁患者分别为36例和44例；肿瘤最大径≤3 cm及>3 cm的分别为46例、34例；病理分级Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级分别为26例、35例和19例；淋巴结转移为43例，未转移为37例，本研究已取得患者同意，且不违背本院伦理规定。

1.2仪器与试剂 HPV16 E7、ACTN4单克隆抗体(美国Abcam公司)，SP9002免疫组化试剂(中国上海鼎杰生物有限公司)；苏木青染色体(中国南京建成生物有限公司)。

1.3方法 常规10%甲醛固定，石蜡包埋，连续4 μm切片，采用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)处理过的载玻片行免疫组化。

1.4免疫组织化学染色检测HPV16 E7、ACTN4表达 严格按照试剂盒说明书进行操作，切片常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，柠檬酸盐缓冲液高压修复1 min，30 mL/L过氧化氢孵育30 min，磷酸盐缓冲液3 min×5次，HPV16 E7、ACTN4一抗(1∶200)5 ℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液3 min×5次，加入聚合物增强剂，35 ℃孵育10 min，磷酸盐缓冲液3 min×5次，加入酶标抗兔聚合物放大剂，常温孵育15 min，磷酸盐缓冲液清洗，苏木精复染5 min，2%盐酸乙醇分化10 s，自来水返蓝15 min，切片自然风干，中性树胶封片，DAB显色后苏木素复染，显微镜下观察拍照。

1.5统计学处理 采用SPSS22.0软件进行统计学处理。计数资料以频数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析诊断价值。联合诊断采用Logistic回归模型构得到新预测变量用于食管癌的诊断。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1食管癌组织和癌旁组织中HPV16 E7、ACTN4表达情况 HPV16 E7阳性的组织标本中，细胞膜和细胞质呈黄棕色。食管癌组织的HPV16 E7阳性表达率为70.00%(56/80)，癌旁正常组织的HPV16 E7阳性表达率为17.50%(14/80)，两者比较差异有统计学意义(χ2=50.40，P<0.001)。ACTN4阳性的组织标本中，细胞质和细胞膜呈淡黄色，食管癌组织的ACTN4阳性表达率为65.00%(52/80)，癌旁组织的ACTN4阳性表达率为22.50%(18/80)，两者比较差异有统计学意义(χ2=33.03，P<0.001)。

2.2食管癌HPV、ACTN4表达与临床病理特征分析 HPV16 E7阳性表达与食管癌患者年龄、肿瘤最大径、肿瘤类型无关(P>0.05)，而与病理分级、淋巴结转移、N分期、M分期有关(P<0.05)；ACTN4阳性表达与食管癌患者年龄、肿瘤最大径、肿瘤类型无关(P>0.05)，而与病理分级、淋巴结转移、N分期、M分期有关(P<0.05)。见表1。

表1 食管癌HPV16 E7、ACTN4表达与临床病理特征分析

2.3HPV16 E7、ACTN4检测用于食管癌诊断的价值 绘制HPV16 E7、ACTN4单独及联合检测用于食管癌诊断的ROC曲线：HPV16 E7检测的灵敏度为81.30%，特异度为80.70%，曲线下面积(AUC)为0.768；ACTN4检测的灵敏度为74.2%，特异度为76.5%，AUC为0.713；HPV16 E7、ACTN4联合检测的灵敏度为90.60%，特异度为86.20%，AUC为0.825。见图1。

图1 HPV16 E7、ACTN4单独及联合检测用于食管癌诊断的ROC曲线

2.4HPV16 E7、ACTN4表达与食管癌患者预后的关系分析 HPV16 E7阳性食管癌患者2年生存率为44.64%(25/56)，HPV16 E7阴性患者2年生存率为70.83%(17/24)，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。ACTN4阳性食管癌患者2年生存率为42.30%(22/52)，ACTN4阴性食管癌患者2年生存率为71.42%(20/28)，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2、3。

图2 HPV16 E7表达与食管癌患者预后的关系分析

图3 ACTN4表达与食管癌患者预后的关系分析

3 讨 论

近年来外科手术在食管癌领域的应用已经取得了明显的进步，但食管癌患者术后生存率以及生活质量方面仍受多种因素影响[5]。因此，深入了解与食管癌发生、发展相关的潜在分子机制，找寻与食管癌预后相关的分子靶点，为日后食管癌等疾病的研究提供有力证据非常必要。流行病学和生物学证据表明，HPV16 E7与食管癌的发生有关，而且食管癌患者HPV的感染率为50%～70%，这也是晚期食管癌患者存活率较低的原因之一[6]。ACTN4作为一种肌动蛋白，可增加肿瘤细胞的活性，并同肿瘤的转移与不良预后密切相关，有研究表示，ACTN4在多种癌症中呈高表达，并在多数癌症中有促进癌细胞增殖的作用，因此研究ACTN4、HPV16 E7在食管癌组织中的表达及其与患者临床病理特征和生存预后的关系尤为重要[7]。

有研究报道食管鳞癌中有ACTN4、HPV16 E7等致癌因子[7]。国内外均有在食管癌组织中检出ACTN4、HPV16 E7等癌基因的报道，证实其致癌率为64%～67%，并认为ACTN4、HPV16 E7升高与食管癌的发生密切相关[8]。本研究的免疫组织化法检测结果显示，食管癌组织中HPV16 E7表达阳性率为70.00%，在癌旁组织中表达为17.50%，ACTN4在食管癌组织阳性表达为65.00%，癌旁正常组织表达为22.50%，表示HPV16 E7、ACTN4均在食管癌中呈高表达，促进疾病发生、发展。在食管癌组织中，对癌细胞增殖起促进作用的ACTN4促癌因子的表达上调会导致癌细胞的异常分化。HPV16 E7抑制MET、EGF等促凋亡因子的表达下调，会使上皮细胞角化并分化多种相关的中间纤维成分，这些改变构成了食管癌细胞特异性的表达，促进了食管癌疾病的发生发展[9]。MENG等[8]研究表明，在癌细胞内，ACTN4可以通过结合转录因子核因子-κB(NF-κB)等产生调控压力进而刺激肿瘤细胞的增殖，增加癌细胞活性，促进食管癌发展。食管癌的致癌机制还可能包括HPV中的E6、E7蛋白诱导的致癌因子。有研究表明，HPV18、16、E7可与E6协同作用，致使人类上皮细胞永生化并导致相应细胞因子产生紊乱，对癌细胞的恶性转化产生促进作用[10]。在食管癌临床病理特征中HPV16 E7与ACTN4的阳性表达在癌症的发生、发展中具有重要的促进作用。本研究结果表明，HPV16 E7阳性、ACTN4阳性与患者年龄、肿瘤最大径、肿瘤类型无关，而与病理分级、淋巴结转移有关。有研究发现，影响食管癌切除术后患者生存率的主要因素是肿瘤的浸润深度和淋巴结转移状况，ACTN4、HPV16 E7阳性表达与细胞癌患者产生的淋巴转移情况呈正相关，ACTN4、HPV可能通过参与细胞转移过程进而促进肿瘤的进展，促进食管癌的淋巴结转移[11]。其潜在机制可能为ACTN4通过与鸟苷激酶联合而调控细胞骨架的组织和黏着，进而影响细胞的活动力和肿瘤转移，食管癌中过表达的ACTN4可刺激食管癌细胞产生侵袭性的细胞突起，使其表现出更强的恶性表型，而HPV则主要凭借病毒癌基因在细胞转化中发挥作用，在已转化的癌细胞中HPV16 E7基因组通常以缺失性方式整合在癌细胞中，并通过引起其他癌基因的异常活动而发挥致癌作用，进而促进食管癌等疾病的发生、发展[12-13]。

本研究结果显示，HPV16 E7阳性食管癌患者的2年生存率为44.64%(25/56)，HPV16 E7阴性食管癌患者的2年生存率为70.83%(17/24)，ACTN4阳性食管癌患者2年生存率为42.30%(22/52)，ACTN4阴性食管癌患者的2年生存率为71.42%(20/28)，提示ACTN4、HPV16 E7可能参与食管癌病程的进展，并对食管癌患者术后的生存期具有一定影响。在食管癌中HPV16是导致正常细胞不稳定性的关键因素，HPV16 E7通过调控相关传导通路进而缩短癌细胞周期，促进癌细胞大量分裂增殖，引起端粒酶等致癌物质的活性增加，使癌细胞分裂增殖失控和癌细胞寿命延长[14]。相关研究表明，ACTN4在人类表皮癌、膀胱癌、胃癌及卵巢癌细胞中均呈高表达，食管癌中ACTN4可通过与Rho家族分子联合，影响正常细胞的活动力和肿瘤转移，进而调控癌细胞组织黏着和癌症的发展[15]。HPV16被认为是候选的癌基因，HPV16 E7的阳性表达越高越能够促进癌症的侵袭和转移，并与膀胱癌、卵巢癌等多种疾病患者的不良预后有着紧密联系，提示HPV16 E7可能位于细胞癌变所经过的共同通路上，且能够普遍参与肿瘤的发生发展[16]。

综上所述，HPV16 E7、ACTN4均在食管癌中呈高表达，并且与病理分级、组织分期和淋巴结转移有关，并能够直接影响食管癌患者预后，可以作为食管癌临床诊断中的重要依据。