小白菊内酯对脓毒症大鼠肠屏障功能的保护作用

郭宁珂，佘 汉，谭 磊，周远群，彭小勇，李 涛，刘良明

453000 河南 新乡，新乡医学院第三附属医院外科1； 400042 重庆，陆军特色医学中心战伤休克与输血研究室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室2

脓毒症(sepsis)是人体对感染反应失调导致的器官功能障碍，是ICU中常见的危重病症，其发生率和病死率均很高。据统计，我国每年有300万脓毒症患者，约100万人死于脓毒症，迄今为止，脓毒症仍然是人类生命安全的巨大威胁。肠屏障功能在脓毒症发生发展的过程中发挥了重要作用。正常情况下，肠道屏障能够有效阻断病原体进入内环境，脓毒症时，肠道屏障被破坏，可导致肠道内菌群及内毒素移位，加重脓毒症的进程，并引起多器官功能障碍甚至死亡。目前关于肠屏障功能保护在脓毒症的治疗中越来越受到关注，保护肠道屏障，降低肠通透性对于脓毒症的防治具有重要的临床意义。目前针对脓毒症的常规治疗措施主要包括液体复苏、抗感染、抗凝等，但对肠屏障功能的保护效果并不显著，因此亟待寻找能够有效保护脓毒症肠屏障功能的新方法。

近年来中药对脓毒症器官功能的保护作用引起广泛的关注，小白菊内酯(

parthenolide

，PTL)是从中药野甘菊中提纯的倍半萜内酯化合物，属于萜类化合物，其来源丰富，价格低廉，同时具有广泛的药理和生物活性。近年来研究发现，PTL具有良好的抗炎效果，对心脏缺血再灌注损伤、类风湿性关节炎等疾病具有重要的保护作用。同时，有研究报道，PTL可显著改善脓毒症大鼠的低血压。然而，PTL对脓毒症大鼠肠屏障功能是否具有保护作用，尚不清楚。为此本研究采用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture，CLP)复制脓毒症大鼠模型，观察小白菊内酯对脓毒症大鼠肠道屏障功能的影响，为脓毒症的防治寻找新的措施。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

成年SPF级SD大鼠，雌雄不拘，体质量(200±20)g，由陆军特色医学中心实验动物中心提供，动物饲养与动物实验过程均遵循动物伦理委员会的规定。PTL(美国Santa Cruz公司)，伊文思蓝(Evans blue，EB)购自美国Sigma公司，白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、D-乳酸、白介素-6(IL-6) 的酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 试剂盒购自武汉伊莱瑞特(Elabscience)生物科技股份有限公司。

1.2 脓毒症大鼠模型制备

大鼠用戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，消毒杀菌剪开腹腔，取出盲肠，将粪便擀至末端，结扎，用锥形器刺穿使粪便漏出，将盲肠还纳回腹腔，缝合伤口，腹腔注射5 mL生理盐水，放回笼中饲养。

1.3 实验方案

将96只大鼠随机分成6组：正常对照(Normal)组、脓毒症(Sep)组、常规治疗(LR)组和小白菊内酯1、5、10 mg/kg组(PTL组)。脓毒症组：采用盲肠结扎穿孔术制作脓毒症模型；常规治疗组：在脓毒症模型制作12 h后，经股静脉输注乳酸林格氏35 mL/kg+多巴胺5～10 μg/(kg·min)，输注3 h，同时肌注头孢呋辛钠100 mg/kg，维持平均动脉压(mean arterial blood pressure, MAP)>70 mmHg；小白菊内酯组：在CLP建立前30 min尾静脉给予小白菊内酯(1、5、10 mg/kg)，脓毒症模型制作12 h后，在常规治疗的基础上给予1、5、10 mg/kg小白菊内酯。每组16只用于观察大鼠存活时间和存活率变化，其中8只用于观察大鼠的血压。

根据大鼠存活率、存活时间和动脉血压确立PTL最佳浓度。后续实验将32只大鼠随机分成4组：正常对照(Normal)组、脓毒症(Sep)组、常规治疗(LR)组和小白菊内酯(PTL 5 mg/kg)组，每组8只，检测肠组织伊文思蓝(Evans blue， EB)含量、血D-乳酸水平、血炎症细胞因子水平、肝肾功能的变化。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 大鼠存活情况观察 待液体复苏结束后，拔出大鼠股静脉插管并结扎，然后缝合伤口。将大鼠回笼饲养，正常饮食饮水，每小时观察1次，观察至复苏后48 h，记录大鼠的存活时间和状态。

1.4.2 肠组织EB含量测定 正常大鼠用30 mg/kg，其余各组用15 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，打开腹腔，截取一段小肠，制备成肠囊，往肠囊中注射EB，冲洗肠腔至冲洗液澄清，烤干加入甲酰胺溶液在酶标仪上650 nm处测定光密度值[

D

(650)]，计算出每克肠干质量所含EB含量，反映肠道通透性。1.4.3 血D-乳酸浓度检测 CLP12 h 后，取大鼠腹主动脉血2 mL，室温下静置20 min，1 000×

g

离心20 min，取上层血清，在酶标板条的各孔中加入标准品或样品，加入酶工作液，再加入显色剂37 ℃孵育10 min，加入终止液，酶标仪上振5 s，于波长530 nm处用比色法测定光密度值[

D

(530)]，制作标准曲线后计算D-乳酸浓度，反映肠道通透性。1.4.4 血炎症细胞因子水平的测定 CLP 12 h 后，抽取大鼠腹主动脉血2 mL，室温下静置20 min，1 000×

g

离心20 min，取上层血清，在酶标板条的各孔中加入标准品或样品，37 ℃孵育90 min，倒去孔内液体，加入生物素化抗体工作液，37 ℃孵育60 min，洗涤3次，加入酶结合工作液，37 ℃孵育30 min，洗涤5次，加入底物溶液，37 ℃孵育15 min，加入终止液，在适宜波长处测定光密度值，分别制作标准曲线后计算各组大鼠血液所含IL-6、IL-1β浓度。

1.4.5 大鼠小肠HE染色 大鼠腹腔麻醉固定，腹部开口，截取距胃端6～7 cm肠段，在冰的PBS溶液中冲洗表面血迹，4%多聚甲醛溶液固定48～72 h。固定时间结束取出肠组织，切成2～3 mm厚的小块，放置脱水盒中慢速水流冲洗过夜，再进行透明、浸蜡及包埋、切片、染色操作，封片晾干后在光学显微镜下观察。

1.4.6 肝肾功能的检测 CLP 12 h 后，取大鼠腹主动脉血2 mL，室温下静置20 min，1 000×

g

离心20 min应用生化自动分析仪检测谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、尿素氮(urea nitrogen，Urea)、肌酐(creatinine，Crea)等指标。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行分析，数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析，

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTL对脓毒症大鼠存活率和存活时间的影响

脓毒症组大鼠48 h存活率为0，常规治疗组大鼠48 h存活1只，存活率为6.2%，平均存活16 h；PTL 1 mg/kg组大鼠48 h存活2只，存活率为12.5%，平均存活时间为20 h；PTL 5 mg/kg组大鼠48 h存活8只，存活率为50%，平均存活时间为34 h；PTL 10 mg/kg组大鼠48 h存活4只，存活率为25%，平均存活时间24 h；PTL 10 mg/kg组大鼠48 h存活率不升反降，可能是由于药物浓度增高时毒性增强所致(图1)，提示PTL的最佳治疗浓度为5 mg/kg。

a：P<0.05，与LR组比较；b：P<0.05，PTL 5 mg/kg组比较

2.2 PTL对脓毒症大鼠MAP的影响

脓毒症组大鼠MAP降低，常规治疗组大鼠MAP较脓毒症组有所升高。与常规治疗组相比，PTL 1 mg/kg组大鼠MAP升高幅度不明显，PTL 5 mg/kg和10 mg/kg组能够显著升高脓毒症大鼠MAP，且PTL 5 mg/kg组MAP高于10 mg/kg组(图2)。提示PTL可显著提高脓毒症大鼠平均动脉血压，最适浓度为5 mg/kg，因此后续实验采用PTL 5 mg/kg。

a: P<0.05，与LR组比较

2.3 PTL对脓毒症大鼠肠屏障功能的保护作用

以EB检测肠屏障功能，结果显示脓毒症组大鼠小肠表面颜色最深，提示EB渗漏最多。正常对照组大鼠小肠EB渗漏少，表面颜色浅，提示肠屏障功能好。PTL治疗后，大鼠肠屏障功能有所改善，EB渗漏减少。PTL 5 mg/kg组EB含量较常规治疗组降低了55.1%，差异有统计学意义(

P

<0.05，图3B)。D-乳酸是肠道内细菌代谢及酵解的产物，是反映肠屏障功能的重要指标。结果显示，与正常对照组相比，脓毒症组血D-乳酸浓度平均增加比例为93.6%；与脓毒症组相比，常规治疗组血D-乳酸浓度降低了74.5%，差异有统计学意义(

P

<0.05)；与常规治疗组相比，PTL5 mg/kg组血D-乳酸浓度降低了69.5%，差异有统计学意义(

P

<0.05，图3C)。脓毒症组大鼠肠上皮细胞脱落、大量炎性细胞聚集，腺体结构破坏，肠道绒毛结构严重破坏脱落；正常对照组小肠黏膜组织形态正常，PTL5 mg/kg组肠上皮结构完整性、绒毛结构、上皮细胞坏死等较脓毒症组有明显改善(图3D)。

a：P<0.05，与Normal组比较；b：P<0.05，与LR组比较

2.4 PTL对脓毒症大鼠血炎症细胞因子IL-6、IL-1β水平的影响

脓毒症组大鼠血中IL-6、IL-1β水平较正常对照组显著升高(

P

<0.05，图4)；常规治疗组大鼠血IL-6浓度较脓毒症组降低了76.0%；PTL 5 mg/kg组IL-6浓度进一步降低，较常规治疗组降低了93.4%，差异有统计学意义(

P

<0.05，图4A)。脓毒症大鼠血IL-1β浓度在常规治疗后下降7.8%；给予PTL治疗后，IL-1β浓度显著降低，较常规治疗组下降了62.4%，差异有统计学意义(

P

<0.05，图4B)。表明PTL可以显著抑制炎症细胞因子释放，抑制炎症反应。

a：P<0.05，与Normal组比较；b：P<0.05，与LR组比较 A： IL-6；B： IL-1β

2.5 PTL对脓毒症大鼠肝肾功能的影响

脓毒症组大鼠AST、ALT水平较正常对照组显著增加，常规治疗组AST和ALT较脓毒症组显著降低， 分别降低了30.4%和38.6%(

P

<0.05)； PTL 5 mg/kg组AST和ALT进一步下降，较常规治疗组分别降低了24.6%和28.5%，差异有统计学意义(

P

<0.05，图5A、B)。脓毒症组大鼠尿素氮和肌酐水平较正常对照组显著增加，常规治疗组大鼠尿素氮和肌酐水平较脓毒症组有所下降，分别下降了27.1%和 20.6%，PTL 5 mg/kg组大鼠尿素氮和肌酐水平进一步降低，较常规治疗组分别降低了25.6%和27.6%，差异有统计学意义(

P

<0.05，图5C、D)。结果提示PTL可以减轻脓毒症时肝、肾功能的损伤。

a：P<0.05，与Normal组比较；b：P<0.05，与LR组比较 A： ALT；B： AST；C： Crea；D： Urea

3 讨论

脓毒症时由于肠屏障功能受损，导致肠道菌群易位，可加重脓毒症和失控炎症反应，并最终导致多器官功能衰竭。为了寻找有效的保护脓毒症肠屏障功能方法，本实验利用CLP脓毒症大鼠模型研究了小白菊内酯PTL对肠屏障功能的保护作用。 结果发现，PTL对脓毒症大鼠肠道屏障功能具有明显的保护作用，可明显降低脓毒症大鼠的肠道通透性，降低脓毒症大鼠血液炎症细胞因子水平，保护其重要器官功能，提高脓毒症大鼠存活率。PTL对脓毒症大鼠肠屏障功能的保护作用可能与其抗炎作用有关。

肠道被认为是多器官功能衰竭的“中心器官”，脓毒症、创伤后肠道屏障功能受损，肠通透性增加，引起肠道细菌和内毒素易位，严重损害各器官功能，最终导致多器官功能衰竭(MODS)。此外，肠道免疫系统的完整性和调节功能是宿主防御对抗外来物的基础，在脓毒症过程中，肠道免疫功能失常，中性粒细胞被激活、大量炎性因子产生、氮氧反应物质释放增加炎症反应。PTL是一种倍半萜类化合物，具有显著的抗炎作用，对缺血再灌注和自身免疫性脑脊髓炎有良好拮抗作用。本研究发现，PTL对脓毒症大鼠肠屏障功能有良好保护作用，同时发现其对脓毒症大鼠肝肾功能也有很好的保护作用，具有很好的抑制炎症反应作用，可显著抑制脓毒症大鼠细胞因子释放。

研究表明PTL可阻断NF-κB信号通路。PTL独特的化学结构能抑制转录因子NF-κB、STATS、JNK，NF-κB的过度激活是脓毒症患者预后不良的标志，可通过NF-κB信号通路抑制过度炎症，抑制多器官功能障碍的发生发展。在以往的研究中发现，IκB激酶可磷酸化降解，导致NF-κB激活。PTL可阻断IκB蛋白的磷酸化和降解，下调磷酸化NF-κB p65的表达。因此，我们推测PTL可能通过调节NF-κB信号通路，减少炎性因子释放，改善脓毒症的肠通透性。当然，PTL保护脓毒症大鼠肠道屏障功能的具体机制需要进一步研究阐明。

本研究结果证实，PTL可以降低脓毒症大鼠肠道通透性、保护肠屏障功能，其机制可能与其抑制炎症因子释放有关。但PTL对脓毒症大鼠肠屏障功能保护的具体机制尚需进一步研究阐明；而PTL在大动物和人脓毒症是否有同样效果亦需要进一步研究证实。