慢病毒介导KIF4A 稳定诱导敲降MCF7 细胞株的建立

闫鲁霞，程蓓蓓，周之春，朱长军

（1.天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2.天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室，天津 300387；3.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）

KIF4A 是驱动蛋白Kinesin-4 家族成员之一，是一类可以利用自身马达结构域水解ATP 获取能量，并沿着微管向微管正极末端方向移动的蛋白分子[1].KIF4A是一类高度保守的蛋白，基因定位于人类染色体Xq13.1，cDNA 共3 699 bp，编码1 232 个氨基酸，蛋白相对分子质量约为140×103[2].KIF4A 作为驱动蛋白，可在细胞周期中稳定表达，参与许多重要的生命活动，在有丝分裂中发挥着必不可少的作用[3].慢病毒载体（lentiviralvector，LV）是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体[4]，属于逆转录病毒，它可将自身的病毒RNA 逆转录为DNA 并与宿主细胞染色体整合，具有感染效率高、转移基因片段容量大、低免疫原性和低细胞毒性等优点，是携带目的基因的理想载体[5-6].四环素基因表达调控系统（包括Teton 系统和Tet-off 系统）是迄今为止在体内和体外应用最为成功和广泛的调控系统之一[7]，该系统利用大肠杆菌Tn10 转座子中四环素阻遏操纵子的调控元件在真核细胞中定量并特异地控制外源基因的表达.

本研究利用慢病毒表达载体，应用Tet 系统诱导KIF4A shRNA 的表达，抑制细胞内KIF4A 蛋白表达，成功构建了KIF4A 稳定诱导敲降的细胞株Tet-shKIF4A/MCF7，为研究KIF4A 在有丝分裂进程中的作用提供了重要的研究材料.

1 材料与方法

1.1 质粒和细胞

psPAX2 和pMD2.G 质粒、293T 细胞和MCF7 细胞，均由本实验室保存；pTet-plko-puro-NC 质粒、pTetplko-puro-shKIF4A 质粒，由旭和（天津）医药科技有限公司合成.

1.2 主要试剂

Polyfectamine 转染试剂、Superfectin 转染试剂，日本Takara 公司；四环素、嘌呤霉素、山羊血清，北京索莱宝科技有限公司；HRP 标记的Goat anti rabbit 和Goat anti mouse，武汉博士德生物工程有限公司；Opti-MEM培养基，美国Gibico 公司；抗荧光淬灭剂，美国Thermo Fisher 公司；Mouse anti KIF4A 抗体，美国Santa Cruz公司；Mouse anti Tubulin 抗体、Rat anti Tubulin 抗体，美国Sigma 公司；Goat anti Mouse488、Goat anti Rabbit546、Goat anti Rat568 抗体，美国Invitrongen 公司；KIF4A 抗体血清，由本实验室制备.

1.3 方法

1.3.1 嘌呤霉素工作浓度的确定

接种3×105个MCF7 细胞于6 孔板中，细胞密度达到90%时，分别添加嘌呤霉素质量浓度为0、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 μg/mL 的细胞培养液，置于细胞培养箱中继续培养，每天更换1 次培养液.观察细胞存活状态，发现在嘌呤霉素质量浓度为0、0.50、0.75 μg/mL 的培养液中，培养3 d 后少量细胞死亡，培养5 d 后部分细胞存活；嘌呤霉素质量浓度为1.00、1.25、1.50 μg/mL的培养液中，培养3 d 后细胞大量死亡，培养5 d 后细胞全部死亡.因此确定1.00 μg/mL 为嘌呤霉素的最佳筛选浓度，后续研究选择该质量浓度的嘌呤霉素进行抗药筛选.

1.3.2 不同转染方式转染293T 细胞制备慢病毒

将293T 细胞接种至6 cm 培养皿，于37 ℃、5%CO2培养箱条件下进行培养，分别使用碳酸钙转染试剂、Superfect 转染试剂、Polyfectamine 转染试剂，将pTetplko-puro-shKIF4A 重组质粒、psPAX2 和pMD2.G 质粒共转染293T 细胞，分别转染12、15、24 h 后，更换新鲜培养基继续培养48 h，收集富含慢病毒的培养液.向收集到的慢病毒培养液中按一定比例加入含100 μg/mL四环素的新鲜培养基，继续感染293T 细胞，48 h 后收集慢病毒感染的细胞进行检测，验证KIF4A 蛋白表达的敲降.

1.3.3 慢病毒感染及稳定诱导敲降Tet-shKIF4A 细胞株的筛选

MCF7 细胞密度达到80%左右时，用收集的含TetshKIF4A 慢病毒液和对照慢病毒液感染细胞48 h，未感染病毒的细胞作为空白对照.感染细胞48 h 后加入嘌呤霉素质量浓度为1.00 μg/mL 的新鲜培养基进行筛选，每隔1 d 更换含嘌呤霉素的新鲜培养基，连续筛选3 代，得到稳定表达的细胞株.

1.3.4 四环素诱导加药处理

接种3×105个稳定诱导敲降Tet-shKIF4A 细胞株于6 孔板中，培养细胞约16h 后，分别按照0、50、75、100、150、200 μg/mL 的质量浓度梯度加入四环素，培养48 h后收集细胞.最终采用四环素质量浓度为50 μg/mL 的培养基，分别在12、24、36、48、60 h 时收集细胞.

1.3.5 蛋白质印迹杂交

加入适量含有溴酚蓝的蛋白上样缓冲液收集细胞，经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，通过半干型转印电泳槽将蛋白转至PVDF 膜，脱脂奶粉封闭过夜.一抗室温孵育2 h（Rabbit anti KIF4A 与Mouse anti Tubulin 的体积比为1∶1 000），TBST 洗3 次；二抗室温孵育1 h（Goat anti rabbit 和Goat anti mouse 的体积比为1∶10 000），加入ECL 和过氧化氢后曝光.成像后用ImageJ 软件分析各蛋白条带的灰度值，用KIF4A 和Tubulin 条带灰度值的比值大小表示细胞内蛋白表达相对水平.

1.3.6 细胞免疫荧光染色

在免疫荧光染色35 mm2平皿中分别接种2×105个对照组细胞和诱导敲降KIF4A 细胞，培养12 h 后，用四环素质量浓度为50 μg/mL 的培养基培养36 h，取出细胞爬片，PBS 洗3 次，用固定液固定5 min.再次用PBS 清洗3 次，在PBS 中4 ℃条件下浸泡过夜.用山羊血清配成的封闭液封闭50 min，用PBST 稀释的Mouse anti KIF4A 抗体（体积比为1∶100）过夜孵育，用PBST 稀释的二抗Goat anti Mouse488（体积比为1∶200）室温孵育1 h，用小鼠血清配成的封闭液进行二次封闭. 按照1∶200 的体积比稀释二抗Goat anti Rat 568，室温孵育1 h.PBST 洗3 次后加入抗荧光淬灭剂，指甲油封片，置于荧光显微镜下观察.

1.4 数据处理

采用SPSS20.0 软件进行统计分析，通过独立样本t 检验，差异具有高度统计学意义（P ＜0.01）.统计图使用Graphpad Prism 9 绘制.

2 结果与分析

2.1 重组表达质粒转染293T 细胞制备慢病毒

分别使用碳酸钙、Polyfectamine、Superfect 试剂盒共转染质粒pTet-plko-puro-shKIF4A、psPAX2 和pMD2.G 至293T 细胞，于不同时间点收集慢病毒液，用收集的慢病毒液感染293T 细胞，四环素质量浓度为100 μg/mL 的条件下继续培养48 h 后收集病毒液，加入适量含有溴酚蓝的蛋白上样缓冲液收集细胞，通过蛋白质印迹法进行KIF4A 蛋白检测，结果如图1 所示.由图1 可以看出，Polyfectamine 转染24 h 所得的慢病毒效果较好，且Polyfectamine 转染试剂经济实惠，因此后续使用Polyfectamine 共转染Tet-plko-puro、psPAX2 和pMD2.G 至293T 细胞，24 h 后收集对照组慢病毒液.

图1 不同转染条件的比较Fig.1 Comparison of different transfection conditions

2.2 稳定诱导敲降Tet-shKIF4A 的细胞株构建以及筛选

分别用Tet-shKIF4A 慢病毒和对照慢病毒感染MCF7 细胞48 h 后，使用嘌呤霉素质量浓度为1 μg/mL的培养基对细胞进行筛选，嘌呤霉素筛选3 代后细胞几乎无死亡现象，表明存活的细胞含有嘌呤霉素抗性.通过3 轮有限稀释法纯化，将稳定表达的单细胞克隆扩大培养，结果如图2 所示.由图2 可以看出，与对照细胞相比，稳定诱导敲降KIF4A 细胞株的状态没有明显的不良改变，因此确认成功构建了Tet-plko-puroshKIF4A 稳定诱导敲降的MCF7 细胞株.

图2 稳定诱导敲降KIF4A 细胞株与对照细胞的比较Fig.2 Comparison between stable inducile knockdown KIF4A cells and control cells

2.3 诱导敲降KIF4A 的四环素药物质量浓度的优化

分别用质量浓度为50、75、100、150、200 μg/mL 的四环素处理Tet-shKIF4A 稳定诱导敲降细胞株，检测KIF4A 蛋白的表达水平，结果如图3 所示.由图3 可以看出，不同质量浓度的四环素对Tet-shKIF4A 稳定诱导敲降细胞株均呈现出一定的敲降效果.用Image J进行定量分析的结果表明，同对照组细胞相比，四环素质量浓度为50 μg/mL 和75 μg/mL 时，KIF4A 的蛋白表达下调，差异具有统计学意义（P ＜0.05）；四环素质量浓度为100、150、200 μg/mL 时，KIF4A 的蛋白表达下调，差异具有高度统计学意义（P ＜0.01）.在显微镜下观察细胞形态，发现质量浓度为100、150、200 μg/mL的四环素对细胞毒性较大，细胞状态不佳，而50 μg/mL的四环素既能达到较好的敲降效果，同时细胞状态较好，因此确定50 μg/mL 为四环素诱导敲降KIF4A 的最佳质量浓度.

图3 不同质量浓度的四环素诱导敲降KIF4A 的效果Fig.3 Effect of tetracycline with different mass concentration on inducible-knockdown of KIF4A

2.4 诱导敲降KIF4A 时间的优化

用50 μg/mL 的四环素加药处理Tet-shKIF4A 细胞株，处理时间分别为12、24、36、48、60 h，通过蛋白质印迹法进行KIF4A 蛋白检测，结果如图4 所示.由图4 可以看出，与未加四环素的对照组细胞相比，四环素稳定诱导敲降细胞株条带的亮度明显减弱，且随着处理时间的延长，亮度逐渐减弱，KIF4A 与Tubulin灰度值的比值在36 h 时出现急剧下降，因此确定最优的诱导敲降时间为36 h，此时效果较好.

图4 不同时间四环素诱导敲降KIF4A 的效果Fig.4 Effect of tetracycline inducible knockdown of KIF4A at different time

2.5 免疫荧光染色

对KIF4A 稳定诱导敲降细胞株和对照组细胞进行免疫荧光染色，结果如图5 所示.同对照组细胞相比，稳定诱导敲降细胞株中KIF4A 特异性染色减少，细胞在有丝分裂早期染色体凝集程度降低，染色体整列出现障碍，后期纺锤体中央区变得松散，纺锤体拉长.因此确认稳定诱导敲降细胞株中KIF4A 出现明显的敲降效果.

图5 Tet-shKIF4A/MCF7 细胞和对照组细胞免疫荧光染色Fig.5 Immunofluorescence staining of Tet-shKIF4A/MCF7 cells and control cells

3 讨论与结论

染色体驱动蛋白KIF4A 是一类高度保守的蛋白，在调控染色体凝集和分离机制、有丝分裂后期微管动态不稳定性和纺锤体的长度等方面扮演十分重要的角色，是一个重要的细胞周期调控蛋白[8-9].KIF4A 的缺失会导致染色体凝集程度降低，影响姐妹染色单体的分离，引起基因组不稳定，导致非整倍体基因组的产生，最终使细胞走向死亡[10].因此稳定敲除KIF4A的细胞株几乎无法构建.利用Tet 诱导调控表达系统对KIF4A 的表达进行诱导调节[11]，将慢病毒载体作为RNAi技术的载体，结合两者的优势，能够实现对目的基因KIF4A 的高效特异性的抑制[12].

基因敲降慢病毒载体能产生表达shRNA 的高滴度病毒[13]，诱导基因表达的稳定功能沉默，是目前最适合体内基因转化甚至基因治疗的载体工具之一[14-15].本研究应用四环素诱导基因敲降慢病毒表达载体质粒转染细胞从而得到具有感染力的重组病毒液，以此病毒液感染宿主细胞进而将目的基因整合到宿主细胞内使其稳定表达，相比传统方式，更具有高效性和特异性.一方面，该载体具有Tet 诱导调控表达系统，可通过添加合适浓度的四环素并控制四环素诱导敲降的时间，以达到精确调控KIF4A 表达的目的；另一方面，该载体系统含有嘌呤霉素抗性基因，可对稳定诱导敲降细胞株进行筛选.研究结果表明，应用四环素诱导的基因敲降慢病毒系统，能够成功构建KIF4A 基因稳定诱导敲降乳腺癌细胞株Tet-shKIF4A/MCF7，诱导敲降KIF4A 的四环素药物最佳质量浓度为50 μg/mL，最佳诱导时间为36 h.通过细胞免疫荧光染色实验，药物诱导KIF4A 基因敲降后，有丝分裂细胞表现出染色体凝集、整列和后期纺锤体异常延长等典型KIF4A基因表达抑制的特征.本研究为深入探究KIF4A 在细胞生命活动中的功能以及细胞周期的分子作用机制提供了重要的实验材料.