植物提取物神经保护活性及作用机制研究进展

廖 阳， 闫荣玲， 黄国文， 尹业师， 刘小文

(1. 湖南科技学院化学与生物工程学院， 永州425199； 2. 湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室， 永州425199； 3. 湖南省银杏工程技术中心， 永州425199)

中枢或外周神经元由于各种原因导致细胞结构异常或破坏即神经元损伤，神经元损伤往往会影响细胞功能，且损伤达到一定程度后会导致细胞内遗传物质DNA受损、Ca2+含量过高以及胞内大量自由基富集，这些事件又会激发细胞程序性死亡。神经细胞损伤与凋亡使机体表现出各种不同症状，帕金森疾病、阿尔兹海默病、亨廷顿病等神经退行性疾病就与神经元损伤及凋亡密切相关。虽然不同类型神经退行性疾病的发病原因、中枢部位、病理进程、典型症状不尽相同，但均出现中枢神经损伤甚至凋亡这一现象。因此，具神经保护功效的活性成分，其可显著抑制神经损伤而成为有效预防或治疗相关神经退行性疾病的重要药物来源。包括传统中药在内的植物资源是筛选治疗人类各类疾病活性成分的天然宝库，且现代药理学研究表明许多植物提取物中含有神经保护活性成分，因此从植物根、茎、叶、花、果等不同部位提取用于神经保护和退行性疾病治疗的活性成分成为近年研究热点[1-3]。

1 导致神经元损伤的原因

1.1 外因

导致神经元损伤的外因包括缺血、缺氧、出血、外伤等。以导致中枢神经损伤的常见外因脑缺血为例，主要原因是血管栓塞造成脑血流量减少、使脑组织缺血的同时氧气供应不足导致中枢神经损伤，且损伤严重程度随着缺血缺氧持续时间的延长而增加，即使采取有效措施及时治疗使缺血组织恢复供血和供氧，依然会使缺血组织及神经系统的病理损害进一步加重甚至不可逆[4]。除此之外，越来越多研究表明，过度运动也可能导致神经元损伤尤其是中枢神经系统中负责掌管学习、记忆、情绪的海马这一部位，因为它会引起海马N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)过度激活，导致神经元出现兴奋性毒性损伤[5]。

1.2 内因

导致神经元损伤的内因往往是神经元自身某些结构与功能的失常，且这些结构与功能失常最先发生在分子水平的某一(些)特定基因或蛋白质上。如Tau蛋白异常修饰与聚集、聚谷氨酰胺毒性蛋白高级结构的异常等就被证明与神经退行性疾病密切相关[6]。大部分蛋白质结构与功能异常是其遗传基因发生突变导致的，如IRF2BPL突变导致其编码的蛋白质功能异常会引发神经性紊乱症状的发生[7]。这些基因的突变程度与患者病症的严重程度之间存在显著相关性，比如发生蛋白质无法完整编码、功能完全丧失的无义突变患者相对基因序列中仅个别核苷酸(碱基)突变的错义突变患者，前者症状更严重；这些基因突变效应往往是显性的，这意味着基因两个拷贝中的其中一个发生突变就会导致个体患病，因此致病率更高[8]。分子水平的异常还会引发细胞器和生物膜结构与功能等亚细胞水平的异常，如生物膜中不饱和脂质过氧化导致膜流动性降低、膜出现空洞、细胞内容物外漏，细胞中自由基增多，最终细胞形态结构、新陈代谢、信号传导等结构与功能出现异常，严重时甚至出现细胞凋亡。

2 具神经保护功效植物提取物活性成分种类

越来越多的植物活性成分被发现具有显著神经保护活性，这些提取物主要集中在萜类、黄酮、皂苷、多酚、酰胺、多糖、生物碱等。通过对提取物进行大孔吸附树脂、正反相硅胶、高效液相色谱，以及核磁共振、质谱等手段分离和鉴定出提取物中部分单体化合物(表1)。

3 植物提取物神经元保护活性

3.1 离体保护活性

3.1.1 细胞损伤诱导及活性检测指标

PC12、SH-SY5Y等模式细胞株或皮层、海马、丘脑等特定中枢部位神经细胞经原代培养和分离得到的细胞常用于植物提取物神经元保护活性检测。离体神经细胞根据研究需要选择鱼藤酮、乙醇、过氧化氢、1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)、丙磺舒(MPTP/p)、β-淀粉样蛋白(Aβ)、NO供体SNP等化学试剂诱导细胞损伤、凋亡，或建立帕金森病(PD)等神经疾病体外细胞模型。在此基础上再往培养体系中加入植物提取物，比较对照组与处理组的细胞形态、细胞活力、细胞增殖等特定指标，来反映提取物是否具有神经元保护活性及活性强弱。检测时常用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞活力、流式细胞仪法分析DNA含量与细胞增殖活性、荧光染色法观察细胞形态、TUNEL法检测细胞凋亡、免疫组化法检测细胞中微管蛋白形态结构、Western Blot法检测蛋白表达、荧光探法检测细胞活性氧含量等。

3.1.2 植物提取物作用效果

银杏、芡实、菟丝子、黄芩等植物提取物可显著减少受损神经元的细胞凋亡数目、降低乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)生成、抑制DNA降解、降低胞质钙离子浓度、提高超氧化物歧化酶(SOD)等酶活、减弱细胞形态异常、改善细胞超微结构、减少细胞核固缩与凝聚、提高细胞存活率和增殖活性[38-41]。提取物除影响神经元的细胞与亚细胞形态结构、生理生化指标外，还会上调或下调相关基因的表达，如绿茶提取物的没食子儿茶素和没食子酸酯就可促进海马神经元凋亡因子Bcl-2表达增高、Bax表达降低[2]； 银杏叶提取物可抑制caspase-3的过度表达[42]；金思维提取物则显著提高了Aβ所导致的体外培养SH-SY5Y细胞PSD-95和p-CREB表达[43]。

3.1.3 保护活性的剂量依赖性

不同植物提取物以及同一植物提取物的不同极性部位，甚至同一极性部位的不同单体化合物之间的神经元保护活性都可能存在显著差异。徐静等[44]比较了银杏叶提取物及其所含单体银杏内酯B对体外培养的大鼠神经元损伤保护作用，研究发现单体银杏内酯B的保护效果更佳，更适于高危人群的预防与干预。有研究发现植物提取物体外神经保护活性呈剂量依赖性，如新生SD大鼠皮层神经元原代培养液中加入的灵芝提取物，能长时间抑制氧糖剥夺-再复氧损伤导致的神经元凋亡，低含量处理时下调了促细胞凋亡相关蛋白如caspase-3、caspase-8表达，但高含量处理时除下调上述蛋白外还能下调caspase-9表达[45]。但这并不意味着提取物给药含量越高效果越好，研究表明，0.1、1.0和10.0 μg/mL的不同含量蓝莓提取物均可减缓过氧化氢导致的大鼠海马神经元氧化应激损伤，但在1.0 μg/mL中间含量下效果最佳，之后含量再增加反而效果减弱。这些研究为人们筛选效果最优而成本最低的植物活性提取物，并基于其研制用于防治神经系统疾病的药物配方提供了依据。

3.2 在体神经元保护活性

3.2.1 动物模型的构建

植物提取物的神经元保护活性在体研究主要在小鼠、大鼠等模式动物上完成。一般通过手术部分损毁特定种中枢部位、中枢核团试剂注射与腹腔注射等手段制得相关神经退行性疾病动物模型。定点手术部分损毁与中枢核团试剂注射会根据研究需要选择皮层、海马、纹状体、丘脑底核、脊髓等特定部位完成[46]；中枢核团试剂注射与腹腔注射制模时，可使用的试剂多样性特征显著，如注射半乳糖/亚硝酸钠诱导老年痴呆动物模型、注射鱼藤酮诱导帕金森病小鼠模型、注射三氯化铝诱导老年痴呆动物模型、注射亚硝酸钠诱导记忆巩固障碍模型、注射l-甲基4苯基-1,2,3, 6-四氢吡啶(MPTP)诱导帕金森模型、联合腹腔注射柠檬酸铝和亚硝酸钠建立认知障碍模型以及脂多糖(LPS)定位注射至黑质诱导帕金森病模型和腹腔注射百草枯和代森锰制备帕金森病模型等[3,47-51]。

3.2.2 神经活性检测指标与方法

常采用灌胃的方法对动物模型进行提取物给药处理，并在持续一段时间后对比对照组与处理组的体征与行为、生理与生化、组织与解剖等指标的变化，以此反映提取物神经保护效果的优劣。如通过观察、称量、计数得到站立次数、旋转次数、爬杆能力、体重、生存率等行为学指标，利用Morris水迷宫检测大鼠认知功能；采用MTT法检测神经细胞活力，RT-PCR检测酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺(DA)、P-糖蛋白(P-GP)、兴奋性氨基酸转运体(EAAT)的 mRNA转录水平，采用酶联免疫吸附法检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性；采用TUNEL法或流式细胞仪法检测神经元凋亡，采用高效液相色谱法检测中枢特定神经递质及其代谢物(如多巴胺及其代谢产物二羟基苯乙酸和高香草酸的含量)；采用激光共聚焦显微镜法检测胞浆内的Ca2+含量，采用Western Blot技术检测P-糖蛋白(P-GP)、兴奋性氨基酸转运体(EAAT)以及Caspase-3等蛋白表达水平，采用免疫组织化学结合电镜观察检测特定中枢部位(如黑质致密区等)酪氨酸羟化酶活性和中枢神经元超微结构和数量。

3.2.3 在体保护活性的具体表现

马齿苋、银杏、山茱萸、狗枣猕猴桃、生姜、金思维、松树等植物的表皮、根茎、叶片等部位提取物被证实具有显著神经保护活性[3,43,47-48,52-54]。银杏提取物可减少帕金森模型动物的旋转圈数、改善学习记忆能力，提高模型动物相关中枢部位神经元数量、神经递质及其转录水平与代谢产物的含量，提高SOD及GSH-PX等蛋白或酶的活性，降低MDA含量和保护神经元超微结构，从而对帕金森病小鼠DA能、TH能神经元均表现出明显保护作用[47-48]。银杏叶提取物还能通过调节不同时间点血管性痴呆大鼠海马区相关蛋白表达，减少脑出血模型大鼠的脑含水量、提高神经元线粒体的数量、减轻线粒体肿胀，从而达到保护神经元的功效和促进神经功能恢复[54]。研究还发现，马齿苋提取物可降低海马区促凋亡蛋白Caspase-3、Bax的表达[34]；山茱萸提取物可有效改善认知障碍大鼠在Morris水迷宫中的游泳轨迹和海马CA1区神经元功能[3]；狗枣猕猴桃叶提取物黄酮可减少局灶性脑缺血后的脑梗死体积以及缺血区凋亡细胞数目(P<0.05)[51]；生姜、金思维提取物可以明显增高AD大鼠相关中枢的SOD、CAT、PSD-95、Shank、TrkA、MAPK、IRS-1/2、PI3K和p-CREB等系列蛋白的表达，减低NF-κB、IL-1β表达，在较好地发挥了神经元保护功效这一基础上，显著改善了大鼠的学习与记忆能力，提高Alzheimer病大鼠的认知功能[43,52]。除中枢神经外，植物提取物对周围神经损伤也具有较好的保护效应。薛锋等[55]发现，银杏叶提取物可显著提高周围神经损伤后的脊神经节感觉神经元的乙酰胆碱脂酶以及酸性磷酸酶活性，改善神经元超微结构，并提高感觉神经元存活率。石蜡切片结合显微观察则证明，银杏叶提取物对烙闭浅层巩膜静脉法得到的持续性高眼压模型大鼠的视网膜神经节细胞具有显著保护作用[56]。

3.2.4 保护活性的含量依赖性

植物提取物在体神经保护活性也呈现显著剂量依赖性。不管是银杏叶提取物对帕金森小鼠TH能神经元的保护效应，还是色钉菇乙酸乙酯提取物对帕金森行为症状改善及其对黑质DA能神经元的保护效应，续断提取物对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的改善及其海马神经元的保护作用，色钉菇乙酸乙酯提取物对脂多糖诱导小鼠黑质星形胶质细胞激活的抑制效应，以及何首乌提取物对化学诱导损伤的小鼠黑质多巴胺能神经元的保护作用，均表现出了明显含量依赖性[1,48-51]。一定含量范围内神经元保护效果会随着浓度增加而逐渐增强，但达到一定含量后，效果增加不再明显甚至可能产生不良效应。杨东娜[51]在研究狗枣猕猴桃叶提取物黄酮对大鼠局灶性脑缺血后神经元的保护作用时发现，小鼠对狗枣猕猴桃叶提取黄酮的最大耐受量大于0.12 g/kg体重。

4 植物提取物神经元保护的作用机制

植物提取物的神经保护作用机制十分复杂，涉及神经细胞的生理生化、物质代谢、信号传导、基因表达等系列胞内重要事件，而且事件间往往存在着紧密的逻辑联系。如图1所示，提取物会通过跨膜信号传导，引起胞内级联放大效应和细胞内部的生理生化反应，并最终上调或下调特定基因的表达水平，受到调节的酶或者蛋白又会进一步影响激发细胞内的生理生化响应。

图1 植物提取物神经保护作用机制模式图Figure 1 Neuroprotective mechanism of plant extracts

4.1 拮抗过度氧化应激

中枢或周围神经损伤后均出现细胞内活性氧(ROS)大量产生、谷胱甘肽(GSH)消耗增加、SOD活性下降、MDA含量增加、乳酸脱氢酶(LDH)增加、线粒体膜电位上升等现象，因此过度氧化应激被认为是神经元损伤的主要原因。在研究菟丝子、马齿苋、绿茶、人参首乌、何首乌、松树皮等中药或其他植物提取物神经保护机制时发现，受损伤神经细胞中自由基、MDA、LDH等含量在提取物给药处理后均显著下降，而抗氧化相关酶或蛋白含量则显著增加，可见提取物提高细胞抗氧化能力、降低细胞氧化应激水平、维持生物膜正常生理功能、最终抑制神经细胞凋亡，因此拮抗氧化应激损伤是其他提取物对各类神经元起到保护作用的重要机制[57-58]。

4.2 抑制细胞代谢异常

代谢足迹研究发现，受损神经元除氧化应激指标发生明显变化外，还会表现出显著的细胞代谢异常。如β-淀粉样蛋白损伤SAMP8小鼠原代海马神经元，其诱发的细胞代谢异常主要集中在叶酸代谢和牛磺酸代谢上，通过高通量质谱解析及文献数据库检索发现，L-磺基丙氨酸(L-Cysteic acid)、二氢叶酸(Dihydrofolate)、分支酸(Chorismate)这3个代谢物浓度较对照组差异显著，通天草提取物干预处理后，这些小分子代谢产物又呈明显上调势，因此植物提取物影响细胞代谢也是发挥神经保护功效的重要机制之一[59]。

4.3 调控基因表达

植物提取物还可通过影响神经细胞特定蛋白质分子或蛋白调控因子的表达水平而发挥神经保护作用。周雅楠等[60]研究发现，高含量藏药旺拉提取物在维护受损神经细胞内微管蛋白结构的同时提高了微管蛋白的表达量，从而发挥出其对Aβ介导的大鼠前额叶神经元损伤的保护作用。山茶花(Camelliajaponica)提取物会上调血管内皮层细胞对内皮源超极化因子的合成与释放，起到保护缺氧损伤海马神经元的功效[8]。然而，受损神经元的另一些蛋白质分子在植物提取物干预下，表达水平不仅未上调还会显著下调，人参-知母-赤芍提取物作用于血管性痴呆大鼠海马神经元时，就下调了海马神经元的N-甲基-D-天冬氨酸受体1(NMDAR1)表达水平，这一蛋白质表达水平的显著改变减轻了海马CA1区神经元的损伤，改善了模型大鼠的学习记忆能力[61]；灵芝(Ganodermalucidum)提取物也通过下调相关基因转录水平，降低小胶质细胞源性炎症因子和细胞毒性因子(NO、TNF-α、L-1β)的产生和释放，抑制小胶质细胞的激活及其神经毒性因子的释放，保护多巴胺能神经细胞[45]。

4.4 逆转铁死亡

铁死亡是近年被广泛关注的一种新型神经元损伤机制。铁死亡的主要特征包括细胞内游离Fe2+介导的芬顿反应，细胞膜脂质的脂质过氧化反应，以及细胞内活性氧(ROS)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等含量明显升高，通过Fe-ROS或者GSH-GPX4-ROS信号通路介导细胞及亚细胞结构发生形态、结构、功能异常，最终导致细胞死亡[62-63]。可见，其表现出明显的铁依赖性，且是一种明显区别于细胞凋亡、自噬、坏死的另一种细胞程序性死亡形式，其调控机制复杂，涉及铁离子代谢、脂质过氧化反应和谷胱甘肽代谢等多个生物学过程，与肿瘤、神经系统疾病、缺血再灌注损伤、肾脏损伤、血液病等多种疾病的病理过程密切相关[64-65]。令人欣喜的是，一些中药及植物提取物如麦冬皂苷D、白藜芦醇、丹参酮、异丁基酰胺化合物等被发现可以有效逆转或者缓解神经元铁死亡的进程。在这些提取物活性成分的作用下，神经细胞中的ROS、过氧化脂质活性、铁含量等均会显著降低，而铁蛋白、GPX4的表达得到提高，从而在阿尔茨海默病、帕金森症等神经系统疾病的治疗上表现出良好的应用前景[66-67]。

4.5 调节细胞信号通路

细胞代谢和信号传递途径的各个环节间相互衔接和影响，不同代谢途径和信号通路之间也相互联系和形成交错的网络，使细胞更好地响应内外环境变化。人们越来越重视从整个信号通路的视角来分析神经保护机制。目前发现与植物提取物神经元保护活性相关的细胞信号通路有环腺苷酸/环腺苷酸依赖蛋白激酶/环磷腺苷效应元件结合蛋白即cAMP/PKA/CREB信号通路、p53-p21通路、PI3K/AKT细胞信号通路、蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase)即PERK通路等。以cAMP/PKA/CREB信号通路为例，细胞内cAMP或钙含量的升高使环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)的Ser133位被磷酸化而活化，被磷酸化后的CREB与真核基因转录调控区TATA框上游cAMP反应元件结合后启动下游基因的转录，从而影响蛋白质表达水平来调节神经元个体甚至整个神经网络的功能。苗鑫等[68]通过研究推测，肉苁蓉毛蕊花糖苷能保护D-半乳糖诱导损伤的PC12神经细胞就上调了cAMP/PKA/CREB信号通路；朱芬芳等[69]利用Western Blot检测丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)和磷酸化AKT含量，发现黄芪提取物能明显促进磷酸化AKT蛋白表达，推测黄芪提取物保护缺氧/复氧神经元可能与上调PI3K/AKT细胞信号通路有关。除上调部分信号通路外，也有一些提取物会下调特定细胞信号通路达到神经元保护的目的，比如脑泰方提取物保护局灶性脑缺血大鼠海马神经元，就可能是通过抑制了PERK通路相关蛋白表达，下调PERK通路实现的[70]；五味子水提取液对叔丁基过氧化氢诱导小鼠皮层神经元衰老有明显保护作用，则可能与p53-p21信号通路下调有关[71]。

5 展望

神经损伤与凋亡导致神经系统相关疾病患者的人数呈不断增加和年轻化趋势，积极发挥天然植物提取物的独特优势，筛选效果显著、作用温和、副作用少的活性成分来预防与治疗神经损伤及相关神经系统疾病是一条可行性强的重要途径。

我国幅员辽阔，一些生长于特殊地形地貌和气候环境中和具有典型地方特色的植物资源还有待深度挖掘。虽然以包括中药在内的植物体或其某一器官为原料进行活性成分直接提取具有低成本等优点，但部分植物种类本身是重要的林木、粮食等经济作物，有些甚至还不可再生。因此，传统开发方式不利于生态保护和粮食安全，摸索建立植物细胞悬浮体系及其最佳生产工艺进行高效率、大规模、更可控的生产是今后的重要研究内容。除挖掘新植物提取物资源外，对已明确具有神经保护高活性的提取物进一步分离纯化，得到高纯度活性成分甚至单体，可使人们更准确地弄清某一提取物的作用机制，开展基于不同单体的复配配方开发，以及特定单体化合物的化学修饰等研究是今后的另一重要研究内容。

植物提取物神经保护作用机制多数还停留在生理生化与组织解剖水平，即使深入到分子水平，也只关注单一基因表达水平变化或单一细胞信号通路相关蛋白表达的变化。然而，细胞内的基因表达及细胞信号通路是相互联系和相互影响的，因此还需更多地从蛋白质组学、转录组学视角来阐释提取物的神经保护作用机制。越来越多的研究表明，药物在作用于脑中枢的同时，往往也同步作用于动物肠道，并影响和调控肠道寄生微生物菌落结构及其代谢产物。这些代谢产物会直接影响肠道上分布地内分泌细胞导致某些特定荷尔蒙分泌量的变化，或进入血管经血液循环达到脑部从而影响中枢神经系统的活动[72]。因此，后续研究不应再单一地关注植物提取物对神经系统的影响，而是更多地从提取物对脑、肠的互作和协同这一角度来进行阐释。另一方面，目前对提取物神经保护活性及其作用机制的在体研究主要集中在大鼠、小鼠等哺乳动物模型上，后续还需更多地开展其他植物提取物作用于人体的相关研究，以期为它们在神经保护相关药物或保健品的研发提供直接和可靠实验依据。